Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar
Summary
Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.
Abstract
Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.
Introduction
Glutamat reseptörlerinin, merkezi sinir sistemi sinapslarda uyarıcı sinirsel iletimin çoğunluğu aracılık eder. Postsinaptik zar omurga başında lokalize iyonotropik glutamat reseptörlerinin iki ana alt tipi, N-metil-D-aspartat (NMDA) ve α-amino-3-hidroksi-5-4-proprionik-metilizoksazol asit (AMPA) reseptörleridir. Membran potansiyelleri istirahat, AMPA reseptörleri sinaptik iletimi sırasında postsinaptik akımının en taşımak. Hipokampta, NMDA reseptör postsinaptik zar içindeki AMPA alıcılarının sayısındaki değişiklikler tetiklenmesinde önemli bir rol oynar: bir "tesadüf detektörü" olarak hareket eden 1 sinaptik gücü 1 değişiklikleri başlatmak için, NMDA reseptör sinaptik mekanizmalar dahildir bir alt hücresel düzeyde öğrenme ve hafıza destekleyecek düşünülmektedir. Presinaptik iletici salıverilmesi paralel olarak sinaptik sonrası nöronu depolorizasyonun yanıt olarak, kalsiyum NMDA vasıtası ile içeri girenreseptör AMPA reseptörü ekleme veya kaldırma 2 başlatmak için. Bu reseptör dinamikleri sinaps plastisite temelini oluşturur: sinaptik kuvvetinde bir azalma uzun süreli depresyon 4 (LTD) ise, sinaptik mukavemetinde bir artış, uzun süreli potansiyasyon 2,3 (LTP) 'dir. NMDA reseptörleri, kendi indüksiyon kontrol edildiği düşünülmektedir sırasında nedenle AMPA reseptörü hareketi, sinaptik plastisite ifadesinden sorumlu olduğu düşünülmektedir.
Sinaptik iletim ve plastisite altında yatan kesin mekanizmaları belirlenmesi ideal sinapsların küçük nüfus, tek sinaps eğitim gerektirir. Bazı sinapslar oldukça nedeniyle sinaptik bağlantıların küçük ve dağınık doğası bu son derece zordur çoğu sinaptik popülasyonlarının bu seviyede, örneğin, 5 Tutulacak kaliks, eğitim için uygundur iken. İki büyük elektrofizyoloji teknikleri tek sinaptik bağlantıları incelemek için geliştirilmiştir: İlk minimal stimülasyon, nereyeBir presinaptik lif kabul edilir E ekstrahücresel uyarılmış. İkinci teknik synaptically bağlı nöronlardan gelen eş zamanlı iki tam hücre kayıtları yapılır kayıtları, eşleştirilmiş. Minimum uyarım önemli bir avantajı, aynı zamanda, bir sinaptik sonrası nöronu kayıt sırasında aksonal yolu içine, hücre dışı bir uyarıcı elektrot yerleştirme içeren gerçekleştirmek için hızlı ve nispeten basit olmasıdır. Bu tekniği kullanarak temel kaygısı, tek bir hücrenin güvenilir uyarılması nadiren yargılamadan sonra deneme garanti edilebilir olmasıdır.
Son on beş yıl içinde biz rutin iki synaptically bağlı piramidal nöronlar 6-17 gelen tüm hücre kayıtları paired var. Bu tekniğin önemli avantajı, yalnızca bir presinaptik sinir tutarlı ve güvenilir şekilde uyarılır olmasıdır. Ayrıca, elektrofizyolojik karakterizasyon değil, aynı zamanda presinaptik nöron 6,18 <farmakolojik işleme izin vermemekte,/ Sup>. Bununla birlikte, nöronlar arasındaki sinaptik bağlantı olasılığı 19 elde etmek için çift bağlantılı zorlaştırır düşüktür. Organotipik beyin dilim kültürlerinin kullanımı sinaptik bağlantı olarak bu engel, in vitro olarak yeniden tesis ve ayrıca elde edilen bağlantı yapısı doğal beyin dokusunda 20 benzerdir aşılmaktadır. Ayrıca, organotipik kültürler için plastisite mekanizmalar sağlayan, LTP, LTD 7-10,12-15,21 ve eşleştirilmiş-darbe kolaylaştırma (KOF) ve depresyon (PPD) 6,22,23 dahil kısa vadeli sinaptik plastisite ek form ifade nöronların çiftleri olarak incelenebilir. Burada bunu başarılı bir şekilde in vitro sistemde eşleştirilmiş kayıtları elde katılan ayrıntılı yöntemler tarifedilmiştir. Bu bilgiler kolaylıkla akut dilimleri ve diğer beyin bölgeleri de dahil olmak üzere diğer deney sistemlerinde, adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada Organotipik hipokampal dilim kültürlerde başarılı eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları kurulması için gereksinimleri tarif etmişlerdir. Eşli kayıtlar da akut dilimleri ve ayrışmış kültür sistemleri 26,27 dahil olmak üzere birden hazırlıkları, yapılabilir. Odak burada sinaptik plastisite (yani LTP ve LTD) uzun formları indüksiyon olmuştur ederken, kısa bu organotipik, akut dilim o eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları vurgulamak önemlidir ve hücre preparatları quantal …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.
Materials
| Organotypic cultures | Paired recordings | ||
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 filter paper | Faraday cage | ||
| #5 forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation – A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down’s syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
