Summary

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

Published: September 15, 2014
doi:

Summary

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Abstract

Com o ritmo de avanço científico acelerando rapidamente, são necessários novos métodos para a neurociência experimental de forma rápida e facilmente manipular a expressão genética no cérebro do rato. Aqui nós descrevemos uma técnica introduzida por Passini e Wolfe para entrega intracraniana direta de transgenes viralmente codificadas no cérebro neonatal mouse. Em sua forma mais básica, o procedimento requer apenas um balde de gelo e uma seringa microlitro. No entanto, o protocolo pode também ser adaptado para utilização com quadros estereotáxicas para melhorar a consistência dos investigadores novas para a técnica. O método baseia-se na capacidade do vírus adeno-associado (AAV) para mover-se livremente a partir dos ventrículos cerebrais para o parênquima cerebral, enquanto o revestimento ainda está ependimária imaturos durante a primeira hora após o parto 12-24. Injeção intraventricular de AAV nesta idade resulta na transdução generalizada de neurônios em todo o cérebro. Expressão começa dentro de dias de injeção e persiste durante a lifetime do animal. Título viral pode ser ajustado para controlar a densidade de neurónios transduzidas, enquanto a co-expressão de uma proteína fluorescente proporciona um rótulo vital das células transduzidas. Com a crescente disponibilidade de instalações nucleares virais para fornecer reagentes tanto off-the-shelf, pré-embalados e preparação personalizado viral, esta abordagem oferece um método oportuna para manipular a expressão genética no cérebro do rato que é rápido, fácil, e muito menos dispendioso de engenharia de células germinativas tradicional.

Introduction

Os métodos tradicionais para modificar a expressão do gene neural exigem demoradas e dispendiosas manipulações da linha germinativa. Alternativa de novo se aproxima, como em eletroporação utero ou injeção lentiviral estereotáxica dar resultados mais rápidos e menos caros, mas têm a desvantagem de necessitar de intervenção cirúrgica complexa 1-3. Além disso, a expressão do transgene tem um intervalo espacial limitada a estes métodos. Aqui, nós descrevemos um método rápido, fácil e económico para a manipulação neuronal difundido através de injecção intraventricular de vírus adeno-associado (AAV) para o cérebro do rato neonatal. O método foi descrito pela primeira vez por John Wolfe e Marco Passini em 2001, onde eles sugeriram pequeno tamanho de partícula de AAV permitiu-se difundir no fluido cérebro-espinal, uma vez que passa a partir dos ventrículos laterais através da barreira ependimal imaturos e para o parênquima cerebral 4, 5. Injecção intraventricular de AAV no interior do frimeira 24 h depois do nascimento rendimentos de transdução virai generalizada de subconjuntos neurais que abrangem todas as regiões do cérebro, a partir dos bolbos olfactivos até o tronco cerebral 6,7. Transgenes Virally-entregues são expressos e ativo dentro de dias de injeção e persistir por até um ano após a transdução. Assim, esta manipulação versátil permite estudos vão desde o desenvolvimento pós-natal precoce do cérebro com o envelhecimento e degeneração no adulto.

Ao adaptar a técnica às nossas necessidades específicas experimental, temos focado principalmente na AAV8 sorotipo porque ele é o mais eficiente na transdução de neurônios 6. Nós mostramos que o título viral pode ser diluído para controlar a densidade de neurónios transduzidas para consequências intrínsecas às células de teste experiências de manipulação genética. Além disso, demonstra-se que dois vírus pode ser co-injectado para produzir os padrões de expressão que favorecem a conjuntos distintos ou de sobreposição de neurónios, dependendo dos serotipos escolhidos paraempacotamento viral. O nosso trabalho expande a versatilidade desta técnica para utilização numa ampla variedade de configurações de neuroscience experimentais.

Protocol

Realizar todos os procedimentos e protocolos que envolvem animais, de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os procedimentos aqui descritos foram analisados ​​e aprovados pelo Colégio Baylor de Medicina Animal Care Institucional e Comitê de Uso. Vírus adeno-associado (AAV) os vectores de replicação incompetente para a entrega do transgene no cérebro de roedores são aprovados para uma utilização nível de biosegurança. …

Representative Results

Bem sucedidos intraventricular rendimentos injeção viral expressão neuronal disseminada e robusto. Aqui nós avaliamos a transdução viral usando YFP ou tdTomato genes fluorescentes sob o controle do frango beta actina promotor (CBA promotor). Estas construções foram embalados em AAV8 e injetado nos ventrículos laterais de ratos neonatos (P0) ICR. Títulos virais elevadas (10 10 partículas por hemisfério) resultou na marcação densa do bulbo olfatório, estriado, córtex cerebral, hipocampo e cerebe…

Discussion

Nós descrevemos um procedimento versátil para manipular a expressão de genes usando neuronal AAV como um veículo para a entrega generalizada no cérebro neonatal mouse. Em comparação com outros métodos de transgénese neuronal, tais como no útero electroporação ou uma injecção intracraniana estereotáxico 2,3, injecção neonatal viral é relativamente fácil e simples. O procedimento básico pode ser realizada em minutos com apenas um balde de gelo e uma seringa de microlitro. Sobreviv…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
ICR outbred mice Harlan Hsd:ICR (CD-1) This strain is also known as CD-1
FVB inbred mice The Jackson Laboratory 1800 5-6 weeks of age
Nestlets Lab Supply NESTLETS
Shepherd shacks Lab Supply SS-mouse
High fat rodent chow Purina Mills PicoLab Mouse diet 20, #5058 This is our standard breeder chow
High fat rodent chow (alternative) Harlan Laboratories Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed
Injection syringe Hamilton 7653-01 10 ml syringe
Injection needles Hamilton 7803-04, RN 6PK PT4 32 gauge, for standard P0 injections
Metal plate for cryoanesthesia McMaster Carr 8975K439 Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop
Small animal stereotaxic device with digital readout David Kopf Instruments Model 940
Universal syringe holder with needle support foot David Kopf Instruments Model 1772-F1
Neonatal frame Stoelting 51625 Officially called a mouse and neonatal rat adaptor
Biohazard disposal bags with sterile indicator VWR 14220-030 Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal

References

  1. De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
  2. Sun, B., Gan, L. Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors. Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).
  3. Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).
  4. Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J Virol. 75, 12382-12392 (2001).
  5. Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77, 7034-7040 (2003).
  6. Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).
  7. Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PloS one. 8, (2013).
  8. Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy. Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).
  9. Bauer, H. C., Bauer, H. Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma. Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).
  10. Cearley, C. N., et al. Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).
  11. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82, 5887-5911 (2008).

Play Video

Citer Cet Article
Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. J. Vis. Exp. (91), e51863, doi:10.3791/51863 (2014).

View Video