Analyse à haut débit de mammifères olfactifs récepteurs: mesure de activation du récepteur via la luciférase activité

Le système olfactif de mammifère a la capacité de répondre à un grand nombre de stimuli odorants, permettant la détection et la discrimination des milliers de substances odorantes. Les récepteurs olfactifs (RUP) sont les capteurs moléculaires exprimés par les neurones sensoriels olfactifs dans l'épithélium olfactif ^12. La reconnaissance de l'odeur de mammifère se produit par l'activation différentielle des RUP par odorants, et la famille ou le gène est vaste, avec environ 1000 murin et 400 récepteurs humains ^12-16. Analyses fonctionnelles antérieures de RUP dans les neurones olfactifs et dans les cellules hétérologues ont montré que différentes substances odorantes sont reconnus par unique, mais qui se chevauchent ensembles de RUP ^10,17-20. Ligands correspondants à RUP est essentiel pour comprendre le code olfactif et essentiel pour construire des modèles viables de l'olfaction. En raison de la difficulté à exprimer des RUP dans des systèmes hétérologues ainsi que le grand nombre des deux substances odorantes et les RUP, ces données ont été largement absent de la fIELD; en effet, moins de 6% des RUP humains ont un ligand publié ^1-11. Ce protocole décrit l'utilisation d'un dosage de la luciférase pour caractériser les interactions odorantes / OU. Ce test permet la caractérisation à haut débit de RUP, une tâche qui est essentielle pour comprendre odorant / OU interactions ainsi que l'élaboration d'un modèle de codage des odeurs.

Études à haut débit de RUP sont confrontées à trois défis majeurs. Tout d'abord, RUP exprimés dans des cellules hétérologues ont été retenues dans le RE et ensuite dégradées dans le protéasome ^21,22, ce qui empêche les RUP d'interagir avec des substances odorantes dans le système de dosage ^{de 23 à 25.} Ce problème a été résolu par la découverte de protéines accessoires qui facilitent l'expression stable à la surface cellulaire d'un large éventail de RUP ^19,26,27. Récepteur-transporteur protéines 1 et 2 (RTP1 et 2) promouvoir ou expression à la surface cellulaire et l'activation en réponse à la stimulation odorante ^19. Sur la base de ce travail, les cellules étaient HEK293Tmodifiée pour exprimer de manière stable à long RTP1 (RTP1L) et RTP2, améliorant l'expression du récepteur de protéine 1, et G _αolf, résultant dans la lignée cellulaire Hana3A ^19,27. En outre, le récepteur de l'acétylcholine muscarinique de type 3 (M3-R) interagit avec RUP à la surface des cellules et augmente en réponse à l'activation ²⁶ des agents odorants. La co-transfection d'un OU avec RTP1S et M3-R en Hana3A cellules résulte de l'expression robuste, cohérente et fonctionnelle d'un large éventail de RUP à la surface de la cellule ^27. Deuxièmement, mammifères ou répertoires sont assez grandes. Chez les êtres humains, par exemple, le répertoire OR est un ordre de grandeur plus nombreux que le répertoire des récepteurs gustatifs, et deux ordres de grandeur plus nombreux que le répertoire des récepteurs visuelle. Bien que le clonage d'un simple OU est un protocole relativement simple, important effort initial est nécessaire pour générer une bibliothèque complète. Troisièmement, même si nous savons que dans la vision, la longueur d'onde se traduit par la couleur etla fréquence de l'audition se traduit pas, l'organisation des odeurs est mal comprise, ce qui rend difficile pour les chercheurs d'interpoler à partir d'un échantillon représentatif de substances odorantes. Bien que certains progrès ont été réalisés sur ce front ^10,28, la carte du paysage olfactif reste incomplète. Dépistage des dizaines de milliers de molécules contre des centaines de RUP est une tâche ardue; criblages à haut débit dans ce domaine nécessitent des campagnes soigneusement définis. Les principaux défis à relever sont ceux de la logistique et des coûts plutôt que sur les problèmes inhérents à la technique. Bien que le dépistage hétérologue n'a pas été largement utilisé pour identifier des ligands par des groupes universitaires, une société privée a utilisé la même technique pour identifier des ligands pour 100 RUP humaines ^29. Malheureusement, ces données restent propriétaires.

Le dosage de la luciférase à haut débit décrit ici présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes alternatives utilisées pour évaluer ou d'activation. Bien que la responsabilitésession de neurones sensoriels olfactifs indigènes ont été mesurées à l'aide d'électrophysiologie et d'imagerie calcique, ces techniques ont des difficultés à taquiner à part qui OU conduit à la réponse d'un neurone en raison du chevauchement dans les propriétés de réponse des neurones olfactifs. Bien que dans un cognement-GFP-étiqueté du récepteur de type ^30,31, délivrant par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques de l'adénovirus murins neurones olfactifs ^32,33, ou d'effectuer une RT-PCR après enregistrements ^17,24,33 peuvent lier des enregistrements de types de récepteurs individuels, ces méthodes sont faible débit et ne convient pas pour les écrans de grande envergure. Systèmes de contrôle hétérologues sont plus évolutive, et deux formes principales se trouvent dans la littérature: les journalistes de la voie de l'AMPc et l'inositol triphosphate (IP3) journalistes de la voie. Lors de la stimulation de l'odeur, RUP activent une cascade de signalisation _αolf G de transduction qui conduit à la production d'AMP cyclique (AMPc) ^12. Par co-transfection d'un gène rapporteur de luciférase de luciole sous le contrôle d'acÉlément de réponse à l'AMP (CRE), la production de la luciférase peut être mesurée en fonction de la réponse de l'odeur, ce qui permet la quantification de l'activation OU. Ou l'activation peut également être lié à la voie IP3 par la co-expression des protéines G telles que G _α15/16 ou un G _α15-olf chimère ^24,25,34. Nous avons choisi le test présenté ici repose sur trois facteurs: (1) la co-expression de RTP1 avec récepteurs olfactifs Rho-marqués améliore l'expression des récepteurs olfactifs à la surface des cellules ^19,27; (2) l'utilisation d'un gène rapporteur AMPc-sensible permet la mesure de OU activation par la voie de second messager canonique; et (3) le test est bien adaptée aux écrans à haut débit.

Ce dosage de la luciférase à haut débit est applicable à une variété d'études de grande valeur dans le domaine de l'olfaction. Premièrement, un grand nombre de RUP peut être criblée contre une seule substance odorante en vue de déterminer le motif de l'activation du récepteur pendant une spodorant ecific. Ce type d'étude a identifié OR7D4 comme le OU chargé de répondre à l'androsténone odorant stéroïde ^8. Inversement, un ou peut être projeté contre un panneau de substances odorantes afin de déterminer le profil de la réponse du récepteur ^10. Lorsque candidat olfactif odorant / OU paires sont identifiés par ces écrans, l'interaction peut être confirmé par la réalisation d'une expérience de dose-réponse examiner la réponse de la salle d'opération à des concentrations croissantes de substance odorante. courbes dose-réponse peuvent également évaluer la variation génétique dans une OU affecte en réponse odorant vitro ^8,9,11,35, et ces études peuvent être étendues à interspécifique OU variation, permettant à l'examen de l'évolution des récepteurs à travers les espèces et les mutations causales dans l'évolution ^36,37, Enfin, ce dosage peut être utilisé pour cribler des antagonistes d'odeurs qui sont capables d'antagoniser ou une réponse à une substance odorante particulier pour une paire odorant / récepteur connue ^38,39. En résumé, cette hauteDosage de la luciférase-débit est applicable à une série d'études qui aideront à caractériser ou des motifs d'activation et de fournir une meilleure compréhension du codage des odeurs dans le système olfactif.