Bu görüntüleme kullanılarak hipoksi küresel RNA sentez analizi için bir tekniği açıklar. RNA tıklayın-kimya etiketleme önceden hipoksi altında gerçekleştirilen ve tek hücre düzeyinde küresel RNA değişikliklerin görselleştirme sağlar olmamıştır. Bu yaklaşım, küresel RNA sentezinde hücreden hücreye değişiklik doğrudan görselleştirme sağlayan, mevcut ortalama RNA tekniklerinin tamamlar.
Oksijen kullanılabilirliği Hipoksi ya da düşürülmesi, pek çok fizyolojik ve patolojik proses yer almaktadır. Moleküler düzeyde, hücreleri uygun ve koordine hücre tepkisi için özel bir kopyalama başlatma programı. Hücre aktiviteleri için kofaktör olarak moleküler oksijen gerektiren çeşitli oksijen sensörü enzimlere sahip. Bu prolile-hidroksilazları ikinci histon demethylases değişir. Hipoksiye hücresel yanıtları analiz çalışmaların çoğu hücresel popülasyonlar ve ortalama çalışmalara dayanmaktadır ve hipoksik hücre bu tip bir tekli hücre analizi olarak nadiren gerçekleştirilir. Burada mikroskopi analizi ve miktar tayini, ardından kontrollü bir oksijen iş istasyonu Click-iT RNA görüntüleme kitleri kullanılarak hipoksi tek hücre düzeyinde, küresel RNA sentezinin analizi için bir metod tarif eder. Farklı zaman uzunlukları için hipoksiye maruz kanser hücrelerini kullanarak, RNA, her hücrede etiketlenir ve ölçülür. Bu analiz sağlar:hipoksik strese aşağıdaki genel RNA sentezinde zamansal ve hücreden hücreye değişiklik görselleştirme.
Hipoksi (Düşük oksijen gerilimlerinin) bir doku için normal oksijen rahatsız olduğu zaman meydana gelir. Çevre oksijen birçok hücre türleri için önemli ipuçları veren, bir besleyici ve bir sinyal molekülü hem de. Çevre oksijen değişiklikler Hipoksi İndüklenebilir faktörler (HIFs) olarak bilinen önemli bir transkripsiyon faktörü ailesinin aktivitesini kontrol dioxygenases bir grup tarafından algılanır. HIFs iki alt-birimden, α ve β oluşmaktadır. Bilinen üç HIF-α izoformu (1, 2 ve 3) ve HIF-1β çoklu ekleme varyantları bulunmaktadır. HIF-1β yapıcı bir şekilde ifade ve çevresel oksijen düzeyleri 1 ile düzenlenmemiştir. HIF-α aile üyeleri dinamik Prolile hidroksilazları (doktora) bir sınıf tarafından düzenlenir ve Faktör HIF (FIH) inhibe edilir; HIF-α 2,3 hidroksilasyon katalize etmek üzere bir ko-faktör olarak oksijen gerektirdiği her ikisi de. Normoksi olarak HIF-α aile üyeleri olarak hidroksilite edilmiş ve proteosom için etiketliE3-Ligazını, von Hippel Lindau (VHL) tarafından al bozulması. Hipoksi ve doktora FIH aktif olmayan ya da düşük bir aktiviteye sahiptir. HIF-α izoformlar, kararlı hale HIF-1β ile bir heterodimer oluşturan ve hipoksik bir ortamda (Şekil 1A), hücresel cevabı sağlayan genlerin transkripsiyonu etkileyebilen 4.
RNA analizi için mevcut teknikler, belirli bir hücre popülasyonu arasında ortalama değerlerinin ölçümü odaklanır. Hücreler onlara düşmanca bir ortamda 5. uyum sağlayan genlerin sayısız transkripsiyonunu başlatarak bir hipoksik uyarana cevap. Bununla birlikte, hipoksi, genellikle bir gradyan olarak mevcut ve hipoksik bir ortamda hücrelerin muntazam hipoksik uyarıcı tabi değildir. Biz hipoksi tek hücre düzeyinde küresel RNA sentezini incelemek için bir oksijen kontrollü bir iş istasyonu tıklayın-iT RNA görüntüleme kitleri bir uygulama tarif.
RNA görüntüleme kiti a kullanırlkyne modifiye edilmiş nükleosid, 5-etinil üridin (AB) ve hücre ve dokuların 6, geçici ve mekansal olarak küresel RNA sentezinin saptanmasını sağlamak için kemoselektif ligasyonu. Kısaca, hücreler hipoksi ve AB mevcudiyetinde kültürlenmiş ile muamele edilir. Daha sonra sabit ve geçirgenleştirildi ve doğmakta olan RNA'ya AB şirketleşme bir azid içeren boya ile AB Kemoselektif ligasyonu ile tespit yapılmaktadır. Bu reaksiyon için tipik bir iş akışı Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Biz hipoksi ile muamele sonucu tek hücre düzeyinde RNA sentezini incelemek için RNA görüntüleme kiti kullanıldı.
Alkin etiketinin küçük boyutlu, özellikle RNA'ya modifiye nükleositin etkili bir birleşme sağlar. Kemoselektif ligasyonu veya 'klik' tepkisi yüksek, verimli, hızlı ve 7-10 özgüdür. Reaksiyon bileşenlerinin tümü bioinert ve reaksiyon, herhangi bir aşırı sıcaklıklara veya çözücü gerektirir. Click reaksiyonu olumsuzlarGeleneksel radyoetiketlenmeye gereksinimi ve çıkış beri sonuçların direkt görüntülenmesini sağlar ışıktır. Buna ek olarak, tespit molekülü kolayca RNA etkileşimli proteinlerin saptanması için antikorlar da dahil olmak üzere multipleks analizine imkan kompleks örnekleri nüfuz edebilir. Bu RNA görüntüleme deney Alexa Fluor ve flöresin (FITC) de dahil olmak üzere, organik boyalar ile uyumludur.
Biz uzaktan nesneler için açık mikroskopi ortamda (omero) bir uygulama kullanarak bizim hücre tedavisi sonrasında RNA sentezi değişimi ölçülür. Omero mevcut açık kaynak kodlu yazılım, http://openmicroscopy.org/ . Bu mikroskop görüntü analizi ve görselleştirme yazılım erişimi ve çok boyutlu, heterojen veri setlerinin yönetimi dahil olmak üzere biyolojik verilerin geniş bir yelpazede, kullanımı sağlar. Istemci uygulaması uzaktan görselleştirme ve karmaşık biyolojik görüntü verileri 11 analizini sağlar;küresel ve tek hücre RNA sentezi görsel değişiklikleri ölçmek için kullanılır. Bu mikroskopta görüntü görselleştirme ve analiz yazılımı kullanarak bu verileri ve bizim RNA görüntüleme deney analiz etmek için gerekli adımlar aşağıda gösterilmiştir.
Bu en fazla 24 saat için hipoksi insan osteosarkom tedavisinde (U2OS) hücreleri aşağıdaki genel RNA sentezinde değişikliklere görünüyordu. Tüm koşullarda olarak, RNA üretim düzeyinde hücre-hücre değişimini tespit edildi. Hipoksi maruz kısa zamanlar hücrelerinde olgunlaşmamış RNA seviyesinde önemli değişiklikler ile sonuçlanmamıştır. Bununla birlikte, hipoksi, 24 saat maruz hücrelerinde üretilen RNA miktarında önemli bir artış ile sonuçlanmıştır. Hipoksiye hücresel tepkilerin çoğu, 4-24 saat kadar uzun süre maruz kalma, aşağıdaki ölçülür. Ancak, bazı mekanizmalar örneğin, çok daha erken yerine konur; NF-KB aktivasyonu hipoksiyaya maruz kalma 12 5-15 dakika içinde gerçekleşir. Kısa hipo Araştırılmasıxia pozlama süreleri bu nedenle garanti edilir ve bu, hücre döngüsü ve apoptoz gibi daha karmaşık tepkiler azaltacağından.
Biz osteosarkom (U2OS) hücreleri RNA sentezi üzerine hipoksi etkilerini incelemek için bir RNA görüntüleme kiti bizim kullanımını tarif etmişlerdir. Bu teknik, nispeten basit olan ve tek hücre düzeyinde genel transkripsiyon ile ilgili verileri sağlar. Biz bir hipoksi odasında etiketleme dahil, bu kit için geleneksel protokolünü değiştirilmiş. Bildiğimiz kadarıyla bu hipoksi RNA sentezi değişiklikleri ölçmek için bu tekniğin kullanımı ilk rapordur. Hiçbir radyoaktif izotoplar gerektirir ve kontrollü atmosfer iş istasyonunda çalışma sınırlamaları ile teknik uyumlu olduğu için kullanılan RNA görüntüleme kiti hipoksi deney için uygundur. Bu teknik endişe verimli tespit ve numune etiketleme ile ortak sorunları. Bu PFA örnek taze ve numunenin düşük arka plan boyama sağlamak için tarif edildiği gibi 'tık' reaksiyonu takip yıkama adımlar gerçekleştirilir düzeltmek için kullanılan son derece önemlidir. Eğer background floresan bu aşama 2.7.4 sonra 1 ml RNA görüntüleme kiti Reaksiyon yıkama tamponuyla bir kez daha yıkama için tavsiye edilir bir sorun haline gelir.
Burada sözü RNA görüntüleme kiti kullanımı ve reaksiyon özgüllük ve hız kolaylığı açısından RNA görüntüleme teknolojisinde önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Bu teknik, öncelikle numune etiketlemek için gereken zaman ile sınırlıdır. RNA görüntüleme kiti, genellikle bu süre içinde oluşacak küresel RNA hızlı değişimlerin incelenmesini engelleyen bir 1 saat etiketleme süre gerektirir. Bu nedenle bizim ilk zaman noktası, 1 saat ve 15 dakika ile sınırlı olduğunu. Bu teknik, büyük ölçüde, örneğin, bu RNA görüntüleme kiti phalloidin lekelemesi ile uyumlu değildir, diğer floresan işaretleri ile uyumluluk reaktif madde ile ilgili birkaç diğer sınırlamalar ile ilişkilidir.
Hücrelerde RNA sentezini okuyan tüm mevcut yaklaşımlar içine tadil edilmiş nükleosidlerin dahil dayanmaktadırYeni oluşan RNA ve farklı yollarla dahil etiketlerin tespiti. Öncü yaklaşım otoradyografi ile algılama ve ardından radyoaktif işaretli RNA öncüleri kullanılarak dayanıyordu. Bu yöntem, hücre döngüsü aşamalarında ve diğer önemli bulgular bir keşfine yol açtı; Ancak, bu tür radyoaktivite çalışmaları, uzun pozlama süreleri ve otoradyografiye 6 düşük çözünürlüklü görüntülerinin hantal doğası gibi dezavantajları bir yeri vardır. Alanındaki bir sonraki önceden radyoaktivite gereğini ortadan kaldırmak için immüno-kimya araçlarını kullandı. RNA immunokimya tespiti ardından Bru katılmasıyla etiketli oldu. Bununla birlikte, etkili bir antikor, DNA ya da hücre morfolojisi kaybına sebep olmuş ve floresan etiketli antikorlar 13 ile ayrıca algılama önlenmesi, pek çok protein epitoplarının zarar RNA erişimi geliştirmek için nükleik asit denatürasyonu gerekli bağlanma. 'Tık kimya' teknolojisinin tanıtımı adım algılama ve t basitleştirilmişO prosedürü otoradyografi ve immüno-kimya ile karşılaştırıldığında. Bu teknoloji, 5-ethyniluridine terminal alkin, Cu (I) 'in varlığında, florofor ile konjuge azit ile bağlanan azid-alkin Hüsgen siklo reaksiyona dayanır. Reaksiyon, hızlı ve özel olan herhangi bir ek adımlar gerektirmez ve diğer hücre bileşenleri immunokimyasal tespiti kolayca uyumludur.
Bu RNA görüntüleme teknolojisi kullanılarak biz hücreleri, aynı tek tabakalı popülasyonda, hipoksiyaya tepki olarak farklı RNA sentez düzeyde olduğunu göstermiştir. Biz RNA üretiminin sadece etkisini incelemek için deney sınırlı; Bununla birlikte, bu RNA üretimi için daha karmaşık bir analiz için tadil edilmiş, çok katlı, ek tepkileri gerçekleştirmek için bu RNA görüntüleme kiti ile tamamen mümkündür. Örneğin, bu tür fosforlu RNA polimeraz II veya transla hatta bileşenlerinin düzeyleri gibi aktif transkripsiyon belirteçleri için özel bir antikor kullanılarak ikinci boyamaprotein dönüştürülür, bu yeni üretilen RNA miktarının bir göstergesini vermek tion amaçlı mümkündür. Örneğin aktin, hipoksi ile önemli ölçüde değiştirmemelidir bir protein gibi ek protein, ek bir kontrol olarak test edilebilir. Farklı hücrelerin farklı RNA sentezi oranları ve hipoksi bile farklı tepkiler olacağı çok muhtemeldir Dahası, farklı hücre tipleri, test edilebilir.
Bu RNA görüntüleme kitin kullanımı tarif edildiği gibi adımlar gerçekleştirilir Resim oldukça basittir. Protokolünde kritik adımlar hücre kaplama, hücre fiksasyon ve boyama ve görüntü alımı içerir. Bu önemli sonucu etkileyecek deney at üzerinde ya da altında birleştiği önlemek için tarif edilen yoğunlukta hücreleri plaka önemlidir. Bu alınan hücrenin en iyi 'anlık' sağlanması, taze fiksatif kullanmak ve bac azaltmak için boyandıktan sonra hücrelerin yıkarken dikkat çekmek için de önemlidiretkili bir analiz için kabul edilebilir bir düzeye kground. Son olarak, görüntü elde etme yöntemi sonraki analiz için yeterince iyi bir kalitede görüntüler elde etmek son derece önemlidir. Biz gibi optik dünyada en çok araştırma yoğun merkezlerinde kullanılan bu protokolde kullanılan mikroskop gibi örnekleri incelemek için mevcut en iyi ışık mikroskobu kullanmanızı öneririz.
The authors have nothing to disclose.
JB, Wellcome Trust doktora öğrencisi, SR laboratuvar bir CRUK Kıdemli Araştırma Bursu (C99667/A12918) tarafından finanse edilen AS, bir CRUK klinik üyesidir. Bu çalışma iki Wellcome Trust Stratejik Ödülleri (097945/B/11/Z ve 095931/Z/11/Z) tarafından desteklenmiştir.
U-2 OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true | |
PBS | Gibco | 14190094 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029 | |
FCS | Gibco | 10270106 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106 | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | DE17-603E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx | |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx | |
0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062 | |
Hypoxia Chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 | |
Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=601107&filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D | |
pFA | Sigma | 76240 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en®ion=GB | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en®ion=GB | |
10M NaOH | Sigma | 72068 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en®ion=GB | |
37% HCl | VWR | 20252.335 | https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or | |
VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483 | |
Actinomycin D | Sigma | A9415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en®ion=GB | |
Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | http://www.appliedprecision.com/ | |
softWoRx [Refered to in text as image processing software] | Applied Precision | N/A | http://www.api.com/softworx.asp | |
CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php | |
Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software] | OME | N/A | http://openmicroscopy.org/ | |
SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software] | Systat Software Inc. | N/A | http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php |