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Biologie

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Published: May 13, 2014
doi:
10.3791/51420
, , , , ,
1Centre for Gene Regulation and Expression, College of Life Sciences,University of Dundee, UK

Summary

우리는 촬상을 사용 저산소증 글로벌 RNA 합성의 분석을위한 기술을 설명한다. RNA의 클​​릭 – 화학 라벨은 이전에 저산소증에서 수행하고 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA 변화의 시각화를 허용하지 않았습니다. 이 접근법은 해외 RNA 합성 세포 간 변화의 직접적인 시각화를 허용하며, 기존의 평균화 RNA 기술을 보완한다.

Abstract

산소 가용성의 저산소증 또는 저하는 많은 생리적, 병리 적 과정에 참여하고있다. 분자 수준에서, 세포는 적절한 조율 세포 반응을 마운트하기 위해 특정 전사 프로그램을 개시. 셀은 그들의 활동을위한 보조 인자로서 분자 산소를 요구하는 여러 산소 센서 효소를 소유한다. 이들은 프 롤릴-hydroxylases에서 히스톤 demethylases에 이르기까지 다양합니다. 저산소증에 세포 반응 분석 연구의 대부분은 세포 집단과 보통의 연구에 기초하고 있으며, 저산소 세포의 이러한 단일 세포 분석으로 거의 수행되지 않는다. 여기에서 우리는 현미경 분석 및 정량화 다음에 산소 제어 워크 스테이션에서 클릭 – IT RNA 이미징 키트를 사용하여 저산소증에있는 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA 합성을 분석하는 방법을 설명합니다. 시간의 길이가 다른 대 저산소증에 노출 된 암 세포를 이용하여, RNA는 각 셀에 표시되고 측정된다. 이 분석은 허용저산소 스트레스 다음 글로벌 RNA의 합성에 시간과 세포에 세포 변화의 시각화.

Introduction

저산소증 (낮은 산소 긴장은) 조직에 정상적인 산소 공급이 방해 될 때 발생합니다. 환경 산소는 많은 세포 유형에 대한 중요한 단서를 제공하고, 영양 및 신호 분자 모두입니다. 환경 산소의 변화는 저산소증 유도 성 요인 (HIFs)로 알려진 필수적인 전사 인자 가족의 활동을 제어 dioxygenases의 그룹에 의해 감지된다. HIFs는 두 개의 서브 유닛, α와 β로 구성된다. 세 알려진 HIF-α의 이소 형 (1, 2, 3)과 HIF-1β의 여러 스플 라이스 변종이 있습니다. HIF-1β는 구성 적 표현과 환경 산소 수준 1에 의해 규제되지 않습니다. HIF-α의 가족 구성원은 동적 프 롤릴-hydroxylases (박사 학위)의 클래스에 의해 규제 요인은 HIF (FIH)를 억제하는; HIF-α 2,3의 수산화을 촉진하기 위해 공동 요인으로 산소를 필요로 둘. 정상 산소 상태에서 HIF-α 가족은 수산화하고 proteosom에 대한 태그E3-리가, 폰 Hippel 린다 우 (VHL) 앨라배마 저하. 저산소증에서 박사 학위 및 FIH는 비활성 또는 감소 활동을해야합니다. HIF-α 아형 안정화 될 HIF-1β와 헤테로 다이머를 형성하고, 저산소 환경 (도 1a)에 대한 세포 반응을 제공하는 유전자의 전사에 영향 4.

RNA 분석을위한 현재 기술은 특정 세포 집단에서 평균 값의 정량화에 초점을 맞 춥니 다. 세포는 그들의 적대적 환경 5에 적응할 수 있도록 유전자의 무수한의 전사를 개시함으로써 저산소 자극에 반응한다. 그러나, 저산소증 자주 그라데이션으로 존재하고, 저산소 환경에서 세포가 균일 한 저산소 자극을받지 않는다. 우리는 저산소증에있는 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA 합성을 검토하는 산소 제어 워크 스테이션에서 Click-IT RNA 이미징 키트의 구현을 설명합니다.

RNA 이미징 키트를 사용하여lkyne 수정 된 뉴 클레오 시드, 5 -에 티닐 우리 딘 (EU)과 세포와 조직 6 시간적 공간적으로 글로벌 RNA 합성의 검출을 가능하게 chemoselective 내고. 간략하게, 세포는 저산소증 및 EU의 존재 하에서 배양으로 처리된다. 그런 다음 고정 per​​meabilized 및 초기 RNA에 유럽 연합 (EU)의 결합은 아 지드 포함하는 염료와 EU의 chemoselective 결찰에 의해 감지된다. 이 반응의 일반적인 워크 플로는 그림 1B에 표시됩니다. 우리는 저산소증 치료의 결과 단일 세포 수준에서 RNA 합성을 검사하는 RNA 이미징 키트를 사용했습니다.

알킨 태그의 작은 크기는 특히 RNA로 수정 된 뉴 클레오 시드의 효율적인 결합을 가능하게합니다. chemoselective 결찰 또는 '클릭'반응은 매우 효율적이고 빠르고 7-10 다릅니다. 반응의 모든 구성 요소는 생체 불활성이고, 반응은 더 극단적 인 온도 나 용매를 필요로하지 않는다. 클릭 반응은 부정기존의 radiolabelling에 대한 요구 사항과 출력 이후의 결과를 직접 시각화 할 수는 빛이다. 또, 검출 분자는 쉽게 RNA-단백질 상호 작용을 검출하기위한 항체를 포함한 멀티 플렉스 분석을 허용 복잡한 샘플을 관통 할 수있다. 이 RNA 영상 분석 알렉사 플 루어 및 형광 (FITC) 등의 유기 염료와 호환됩니다.

우리는 원격 객체에 대한 오픈 현미경 환경 (OMERO)의 구현을 사용하여 우리의 세포 치료 다음 RNA 합성의 변화를 측정 하였다. OMERO은에서 사용할 수있는 오픈 소스 소프트웨어입니다 http://openmicroscopy.org/ . 이 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어에 대한 액세스, 및 다차원, 이종 데이터 세트의 관리를 포함하는 생체 데이터의 광범위한 사용을 가능하게한다. 클라이언트 애플리케이션은 원격 시각화 복잡한 생물학적 화상 데이터 (11)의 분석을 허용한다;우리는 글로벌 및 단일 세포 RN​​A의 합성에 시각적 인 변화를 계량화하는 데 사용됩니다. 이 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용하여 이러한 데이터하고 RNA 이미징 실험을 분석하기 위해 필요한 단계를 이하에 나타낸다.

우리는 최대 24 시간 동안 저산소증 인간 골육종의 치료 (U2OS) 세포 다음 글로벌 RNA 합성의 변화를 바라 보았다. 모든 상황에서, 우리는 RNA 생산의 수준에있는 세포에 세포 변화를 감지했습니다. 저산소증 노출의 짧은 시간에 초기 세포 RN​​A의 수준에 큰 변화가 발생하지 않았다. 그러나, 저산소증에 24 시간 노출은 세포에서 생성 된 RNA의 양을 크게 증가 결과. 저산소증에 대한 세포 반응의 대부분은 같은 4-24 시간으로 노출의 장기간, 다음 측정된다. 그러나 일부 메커니즘은, 예를 들어, 훨씬 이전에 장소에 배치됩니다; NF-κB의 활성화는 저산소증 노출 12 ~ 15 분 이내에 발생합니다. 짧은 저자 조사쌰 노출 시간 따라서 보증하고, 이러한 세포주기 및 세포 사멸과 같은 더 복잡한 반응을 손상 할 수 있습니다.

Protocol

1. 세포 배양 및 치료 문화 인간 골육종 (U2OS) 세포에 표 1에 열거 된 시약 및 장비를 수집합니다. 모든 시약을 제조하고 무균 수 있도록 층류 공기 유동 후드에서 모든 조직 배양 기술을 실시 다음과 같이 문화 매체를 준비 : 10 % (FCS)의 최종 농도를 달성하기 위해 DMEM에 50 ㎖의 FCS, 5 ㎖의 L-글루타민 및 5 ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가, 2 개 mm (L-글루타민), 50 U / ㎖ ( 페니실린) 50 U / ㎖ (스트렙토 마이신). 물을 욕조에 37 ° C에서 배양 배지를 따뜻하게. 치료를위한 세포를 준비 70 % 에탄올에 몇 가지의 coverslips를 소독, 6 개의 3.5 cm 플레이트의 하단에 하나를 공기 건조하고 배치 할 수 있습니다. 2 ㎖의 커버 슬립들이 우물의 바닥에 부착하게 유지하려면 커버 슬립 집게로 아래로 눌러, 전체 DMEM (37 ° C)를 따뜻하게 담가. 자신의 조직 숭배에서 U2OS 세포를 분리4 ML을 적용, 3 ㎖의 PBS로 한번 세척하여 우레 판은 0.05 % 트립신-EDTA (1 %)을 따뜻하게하고 7 분 동안 37 ° C에서 배양. 6 ㎖에 재현 탁 세포는 트립신-EDTA를 불 활성화 및 혈구를 사용하여 계산하는 완전한 DMEM을 따뜻하게. 1.3.1 점에서 제조 된 3.5 cm 플레이트의 각 플레이트 2 × 10 5 세포. 부드럽게도 셀 분포를 확인하기 위해 판 바위. 세포가 치료 전에 하룻밤을 준수 할 수 있습니다. 저산소증의 워크 스테이션에 4 개의 3.5 cm 플레이트를 배치하여 세포를 치료하고 정상 산소 조건에서 37 ° C에서 인큐베이터에있는 다른 2 개의 3.5 cm 판을 둡니다. 저산소증의 치료가 끝나기 전에 (저산소증 처리 된 세포의 저산소 챔버에서) 처리 조건에서 RNA 라벨링 분석 1 시간을 개시 할 준비가. 1 시간 15 분, 1 시간 30 분, 2 시간, 24 시간 동안 저산소 세포를 노출합니다. 이 시점은 유연하고 사용자가 결정됩니다. normo를 사용양성 대조군과 음성 대조군으로 4 시간 동안 티노 마이신 D (10 ㎍ / ㎖의 최종 농도)로 처리 정상 산소 3.5 cm 플레이트로 XIC 3.5 cm 플레이트. 악 티노 마이신 D 글로벌 RNA 합성의 억제입니다. 주의 사항 : 훽스트 33342 알려진 돌연변이입니다. DMSO는 조직으로 유기 분자의 진입을 용이하게하는 것으로 알려져있다. 수산화 나트륨은 부식성이. 염산은 부식성이. 파라 포름 알데히드는 모든 동물에 매우 독성과 인간의 죽음의 원인이 될 수 있습니다. 트리톤 (Triton) X-100은 직접 접촉 다음의 경우 피부 자극을 일으킬 수 있습니다. 악 티노 마이신 D 때 피부 나 섭취와 접촉 독성이다. 모든 유해 화학 물질을 취급 할 때 적절한주의하십시오. 2. 클릭 – IT 분석보기 – 7.6, PBS 3.7 % 파라 포름 알데히드 (PFA), 1 % 트리톤 X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) pH를 7.2 : 클릭 – IT 분석 키트 외에 필요한 다음과 같은 시약을 수집PBS에서 -100, 탈 이온수 DH (2 O), 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 10 M 수산화 나트륨 (NaOH) 및 37 %의 염산 (HCL); 옵션 – 산도 표시기 스트립. 다음과 같이 클릭-IT 반응을 수행하기 전에 신선한 PFA 주식 솔루션을 준비 : 1.85 g PFA, 50 ML 팔콘 튜브에 3.5 ㎖의 dH보다 2 O 및 M NaOH를 of10 10 μl를 넣어. 물 목욕을하고 흄 후드에서이 서 전자 레인지에 큰 비커에 H 2 O 400 ㎖ – 300 끓인다. 물을 욕조에 50 ㎖의 송골매를 놓고 부드럽게 PFA가 용해 될 때까지 주기적으로 뚜껑을 발표, 10 분 동안 교반한다. 37 % 용액의 결과로, 또 다른 50 ㎖의 팔콘 튜브에 0.2 μm의 필터를 통해 PFA 용액을 주사기. PBS를 추가하여 10 배 희석하고 진한 염산 12 μL에 대한 추가하여 6.8으로 산도를 가져옵니다. 옵션 : 흄 후드의 표시 스트립 정확한 산도를 확인합니다. 즉시 사용 또는 o 저장vernight에서 4 ° C. 다음과 같이 RNA 이미징 키트의 주식 솔루션을 준비 : 유럽 ​​연합 (EU)의 100 mm의 원액의 결과 구성 요소에 373 ㎕의 Dh를 2 O를 추가합니다. 최대 1 개월 -20 ° C에서 보관. 구성 요소 B (알렉사 플 루어 594)에 DMSO의 85 μl를 추가하고 피펫 또는 소용돌이로 교반하여 혼합한다. 최대 1 년 -20 ° C에 모두 저장합니다. RNA 이미징 키트 반응 버퍼 첨가제의 10X 솔루션을 만들 구성 요소 E에 2 ㎖ dH보다 2 O를 추가합니다. 솔루션은 브라운 색상을 개발하는 경우 최대 1 년 -20 ° C에서 보관은 버린다. 유럽 ​​연합 (EU)과 세포의 레이블 : 데워진 완전 배지 (37 ° C)에서 2.3 단계에서 제조 된 100 밀리미터 재고 EU의 2 배 작업 솔루션을 준비합니다이 단계의 나머지 부분을 수행하고 저산소증으로 처리 된 세포의 저산소 챔버에서 2.5 단계. . 미디어 CONT이 2X 작업 용액의 동량을 첨가하여 1X로 희석세포를 aining. 치료 세포 배양 조건에서 1 시간 동안 배양한다. 셀 고정 : 잘 PBS로 한번 각을 씻고 처리 조건에 따라 위의 단계 2.2에서 제조 된 3.7 % PFA 주식의 1 ML을 추가합니다. 처리 조건에서 15 분 동안 배양한다. 저산소증 처리 샘플은이 지점에서 저산소증 챔버로부터 제거 될 수있다. 정착액을 제거하고 PBS 잘 한 번씩 세척 (책임 낭비 PFA 처분주의). 실온에서 다음 단계를 수행합니다. Permeabilization : 세척 용액을 제거하고 각 웰에 PBS에 1 % 트리톤 X-100 1 ㎖를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 배양한다. permeabilization 버퍼를 제거하고 PBS 잘 한 번씩 씻는다. 레이블 RNA 검출 : dH보다 2 O.에서 10X 솔루션 (단계 2.3에서 준비) 1:10 희석하여 RNA 이미징 키트 반응 버퍼 첨가제의 신선한 1X 작업 솔루션을 준비합니다 RNA 이미징 키트를 준비바로 준비 후 사용 표 2에 따라 반응 칵테일. 세척 용액을 제거하고 각 샘플에 RNA 이미징 키트 반응 칵테일 500 μl를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 배양한다 빛으로부터 보호한다. RNA 이미징 키트 반응 칵테일을 제거하고 RNA 이미징 키트 반응 린스 버퍼 (구성 요소 F) 1 ㎖로 한 번 세척 한 후 RNA 이미징 키트 반응 린스 버퍼를 제거합니다. 선택 다중 반응 : 제조업체의 권장 사항에 따라이 시점에서 샘플을 추가로 항체 라벨을 수행합니다. DNA 염색 : PBS로 세척 샘플 후 세척 용액을 제거. PBS의 훽스트 33342 (구성 요소 G) 1:1,000 희석. 각 웰에 희석 훽스트 33342의 1 mL를 넣고 실온에서 15 분 동안 품어, 빛으로부터 보호합니다. 훽스트 33342 솔루션을 제거하고 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 세척 solutio를 제거n 및 광학 현미경으로 진행합니다. 3. 광학 현미경 마운트 Coverslips는 : 표준 현미경 슬라이드의 중앙에 장착 매체의 10 μl를 놓습니다. 설치 매체의 분취 량을 충당하기 위해 아래 현미경 슬라이드의 중심에 셀 측에 커버 슬립을 놓습니다. 이것은 이후의 화상 획득을 모호하게되므로 장착 매체에 거품의 발생을 피하기 위해 조심. 그 주변에 분명 손톱 광택을 적용하여 현미경 슬라이드에 coverslip에 스틱. 실온에서 5 분 동안 건조 할 수 있습니다. 빛으로부터 보호합니다. 샘플은 다음과 같은 설치 -20 ° C에서 저장 될 수있다. 이미지 수집 : 형광 검출 가능한 광 시야 현미경을 사용하여 이미지를 획득. DNA에 결합 알렉사 형석 염료 및 훽스트 33342에 대한 대략적인 형광 / 여진 발광 최대를 표 3에 나타낸다. Perfor냉각 CCD 카메라로 40X/1.30 NA 기름 침지 렌즈와 이미지를 캡처를 사용하여 M 이미징. 4. 데이터 분석 화상 처리 소프트웨어 (재질 표 참조) 전에 OMERO 클라이언트에 오기까지를 사용 Deconvolve 이미지. 모든 다른 조건으로 제어 정상 산소 세포로부터 렌더링 설정을 적용하여 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어에서 동일한 실험에서 모든 이미지의 설정을 렌더링 정상화. 각 이미지에서 핵을 선택 현미경 이미지의 시각화 및 분석 소프트웨어의 관심 영역 (ROI) 도구 (재료 표 참조)를 사용합니다. 각 ROI에 대한 평균 농도를 구하여 30-50 세포 사이 번호 등, 강도 분석 옵션을 선택하여 각 조건에 대해 평균 및 표준 편차를 산출한다. 4.2 단계 t에서 얻은 모든 개인의 평균 강도 값을 플로팅하여 데이터 그래프 소프트웨어 (재료 표 참조)을 사용하여 분산 형 플롯을 구축O 각 조건에서 세포 사이의 다양성을 반영합니다. 또는 평균 평균 강도 플러스 초기 RNA의 표준 편차를 나타내는 막대 그래프를 구성합니다.

Representative Results

RNA 이미징 키트 반응의 회로도는 그림 1B에 표시됩니다. 우리는 정량적으로 개인 (단일 셀) 및 글로벌 수준 (세포의 인구) 모두에서 저산소증 치료 다음 U2OS 세포에서 총 RNA의 합성을 결정하는 반응을 이용했다. 세포는 저산소증 및 EU의 존재 하에서 배양을 시행 하였다. 그런 다음 고정 per​​meabilized과 유럽 연합 (EU)의 결합은 아 지드 포함하는 염료와 EU의 chemoselective 결찰에 의해 발견되었습니다했다. 이것은 검출 된 형광 광 현미경을 사용하여 정량화 될 수있는 형광 방출의 반응 결과를 '클릭'.도 2a는 본 실험에서의 전형적인 결과를 나타낸다. 형광 표지 된 세포는 빨간 모조 착색하고 이미지가 원격 객체에 대한 오픈 현미경 환경 (OMERO)에 개설되었습니다. 이 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어가 내장되어 개별 하위 세포 구 조를 선택하는데 사용될 수있다 ROI 도구정량적 뚜 및 선택 영역 내에서 이미지의 강도를 분석 할 수 있습니다. 클라이언트 프로그램이 도구의 사용에 다음 데이터 출력의 전형적인 예는도 2b에서 볼 수있다; 개별 셀의 강도는 데이터의 유효 기간을 확인하기 위해 육안 검사 역할을하는 실험의 대표 이미지와 함께 표시됩니다. 개별 셀 형광 농도는 처리 된 세포 집단 내의 개별 셀룰러 농도의 분포를 보여주는 캐터 차트로 나타내 어질 수있다. 그래프의 종류의 예는도 2c에서 볼 수있다. 이 처리 결과의 신속한 비교를 허용하고 명백하게 다르게 기본 데이터 표현을 사용 가려 처리 세포 집단 내의 상당한 이질성을 설명하기 때문에이 방법으로 강도 데이터를 플로팅하는 것이 유용하다. 응답 이질성이 실험에 흥미 균일 한 저산소 자극이 있었지만 때문에셀 pplied, 동일 단층 모집단에서 모든 세포가 자극에 다르게 반응하는 것이 분명하다. 그림 2D는 우리의 실험에서 전체 결과를 보여줍니다. 처리 인구 내의 모든 세포에서 형광 강도는 평균 다음이 막대 차트에 그려진했다. 학생의 t-시험은 제어 크게 상이한 각 처리 군의 통계적 확률을 계산하는 데 사용되었다. 흥미롭게도, 이러한 데이터는 항상 1보다 큰 시간 30 분 (U2OS 세포를 저산소 상태로 처리되어 시간에 따른 해외 RNA 합성에 통계적으로 유의 한 증가가 있음을 보여준다 * p <0.01]. ** p <0.05 *** P <0.001 N> 30). 이러한 데이터는 저산소증 치료의 긴 기간 다음, 세포도이 적대하는 저산소 환경에서 RNA의 생산에 노력을 집중한다 것을 보여줍니다. 악 티노 마이신 D의 처리는 완전히 예상대로 형광 강도를 절제한다. 그림 1. A. HIF 시스템은 세포의 산소의 변화에 응답합니다. 이 개략적 저산소증에 프 롤릴 수산화 효소 (박사 학위)과 폰 Hippel-Lindau에서 단백질 (VHL)에 의해 그 이후 polyubquitination에 의해 HIF-α 수산화 (-OH)를 방지하여 HIF의 이종는 안정. . B.의 RNA 합성은 클릭 – IT 분석을 이용하여 검출 할 수있다 세포 저산소증에 대한 세포 반응을하는 데 도움이 수많은 유전자의 활성화에 HIF 안정화 결과; 세포가 클릭 반응이 형광 강도와 광학 현미경에 의해 정량화 될 수있다 RNA 합성을 감지 치료 후 EU로 표시되어 있습니다. 큰 적이있는를 보려면 여기를 클릭하세요이 그림의 이온. 그림 2. OMERO에서 A. 스크린 샷 RNA 라벨링 다음과 같은 일반적인 미세한 출력을 표시합니다. 이 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어는 신속 내장형 ROI 매크로를 사용하여 개별 셀 레벨에서 강도 데이터를 추출 할 수있다. 이 명령의 출력의 스크린 샷이 B. 글로벌 RNA의 합성에 도시하는 것은 개별 셀의 강도에서 유추 할 수있다,의 범위는 * P C.이 집계 데이터의 형식적인 표현이 D. 볼 수 있습니다 산점도에서 볼 수 있습니다 <0.01; * P <0.05 *** p <0.001 N> 30. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. <tabl전자 국경 = "0"cellpadding이 = "0"cellspacing = "0"> 세포 배양 시약 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 pH 7.2-7.6 둘 베코의 수정 이글스 중간 (DMEM) 태아 혈청 (FCS) 필터 소독 페니실린 / 스트렙토 마이신 L-글루타민 0.05 % 트립신-EDTA (1 %) 70 % 에탄올 악 티노 마이신 D (1 ㎍ / ㎕의 주식) 세포 배양 장비 멸균 파스퇴르 피펫 문화에 세포의 유지 관리 및 치료에 적합한 세포 배양 처리 된 플라스틱 제품의 범위 물 목욕은 37 ° C로 설정 층류 공기 유동 후드 창업 보육 센터는 37 ° C에서 5 % CO 2를 설정 저산소증 워크 스테이션은 37 ° C에서 5 % CO 2, 1 % O 2를 설정 유리 커버 슬립 정밀 핀셋 혈구 표 1. U2OS 세포의 배양에 필요한 시약 및 기기. 반응의 구성 요소 Coverslips는 수 1 2 4 5 6 10 클릭-IT RNA 반응 버퍼 (구성 요소 C) 428 μL 856 μL 1.7 ML 2.1 ML 2.58 ML 4.3 ML CuSO 4 (구성 요소 D) 20 μL 40 μL 80 μL 100 μL 120 μL 200 μL 알렉사 형석 아 지드 (단계 2.3에서 준비) 1.8 ㎕의 3.7 ㎕의 7.4 ㎕의 9.3 ㎕의 11.28 μL 18.8 μL 클릭-IT 반응 버퍼 첨가제 (단계 2.3에서 준비) 50 μL 100 μL 200 μL 250 μL 300 μL 500 μL 대략적인 총 양 500 μL 1 ㎖ 2 ㎖ 2.5 ML 1.5 ML 5 ㎖ . 표 2 RNA 촬상 키트 반응 칵테일 : 염색되는 커버 슬립의 개수에 따라 RNA 촬상 키트 반응을위한 마스터 믹스 성분의 비율을 자세히 참조 테이블. 형광 여기 (NM) 방출 (NM) 알렉사 플 루어 488 495 (519) DNA에 결합 훽스트 33342, (350) 461 . 표 3 형광 / 여기 발광 최대 : DNA에 결합 알렉사 플 루어 염료 및 훽스트 33342에 대한 대략적인 형광 / 여기 방출 최대.

Discussion

우리는 골육종 (U2OS) 세포의 RNA 합성에 저산소증의 영향을 검토하는 RNA 이미징 장비의 우리의 사용을 설명했다. 이 기술은 비교적 간단하고 단일 세포 수준에서 해외 전사에 대한 데이터를 제공한다. 우리는 저산소 챔버에서 라벨을 통합하는이 키트에 대한 기존의 프로토콜을 수정했습니다. 우리의 지식이 저산소증의 RNA 합성의 변화를 측정 할 수있는이 기술의 사용의 첫 번째 보고서입니다. 이 방사성 동위 원소를 필요로하지 않고 통제 된 분위기의 워크 스테이션에서 작업의 한계를 기술적으로 호환이기 때문에 우리가 사용하는 RNA 이미징 키트는 저산소증의 실험에 적합하다. 이 기술에 관심 효율적으로 고정하고 샘플의 라벨 일반적인 문제. 그것은 PFA는 샘플이 신선하고 샘플의 낮은 배경 염색을 보장하기 위해 설명 된대로 '클릭'반응에 따라 세척 단계를 수행하는 고정하는 것이 매우 중요합니다. B의 경우ackground 형광이 단계 2.7.4 후 1 ㎖의 RNA 이미징 키트 반응 린스 버퍼로 한번 더 세척하는 것이 좋습니다 문제가된다.

여기에 언급 된 RNA 이미징 키트는 사용과 반응의 특이성과 속도의 용이성 측면에서 RNA 이미징 기술에 상당한 진보를 나타냅니다. 이 기술은 주로이 샘플 레이블을하는 데 걸리는 시간에 의해 제한됩니다. RNA 이미징 키트는 일반적으로이 기간 내에 발생할 수있는 글로벌 RNA의 급격한 변화의 시험을 방지하는 1 시간의 표시 기간이 필요합니다. 이러한 이유로 우리의 처음 지점을 1 시간 15 분으로 제한됩니다 때문이다. 이 기술은 주로 예를 들어,이 RNA 이미징 키트 phalloidin도 염색와 호환되지 않습니다, 다른 형광 마커와의 호환성을 시약에 관해서 몇 가지 다른 제한과 관련이 있습니다.

세포의 RNA 합성을 공부하는 모든 기존의 접근 방법으로 변형 된 뉴 클레오 시드의 결합을 기반으로초기 RNA와 다른 방법으로 통합 라벨의 검출. 선구적인 접근 방식은 오토 라디오와 검색 다음에 방사성 표지 된 RNA 전구체를 사용하여 기반으로했다. 이 방법은 세포주기의 단계 및 다른 중요한 발견 발견되었다; 그러나, 이러한 방사능 작업, 긴 노출 시간과 오토 라디오 6의 낮은 해상도의 이미지의 성가신 성격 등 많은 단점이있다. 필드 다음 사전 방사능의 필요성을 제거하기 위해 면역 화학 수단 악용. RNA는 면역 화학 감지 다음 BRU의 결합에 의해 표시되었다. 그러나, 효율적인 항체는 DNA 또는 세포 형태의 손실을 야기하고 형광 표지 된 항체 (13)와 자신의 추가 검출을 방지, 많은 단백질의 에피토프를 손상 RNA에 접근을 개선하기 위해 핵산 변성 요구 바인딩. '클릭 화학의 기술의 도입은 검출 단계와 t을 단순화그 절차 오토 라디오 및 면역 화학에 비해. 이 기술은 5 ethyniluridine 단자 알킨은 구리 (I)의 존재 형광가 결합 아 지드와 결합 지드 – 알킨 Huisgen의 고리 화 반응을 기반으로합니다. 반응은 신속하고 특정 추가 단계를 필요로하지 않으며, 다른 세포 성분의 면역 검출와 쉽게 호환됩니다.

이 RNA 이미징 기술을 사용하여, 우리는 세포가 동일한 단층 인구에서 저산소증에 반응하여 상이한 RNA 합성 수준을 가지고 있음을 보여 주었다. 우리는 RNA 생산 만의 효과를 조사하기 위해 실험을 제한; 그러나, RNA 생산의 더 복잡한 분석을 허용 변경됨 추가적인 다중 반응을 수행하기 위해이 RNA 촬상 키트 전적으로 가능하다. 예를 들어, 인산화 된 RNA 중합 효소 II 또는 그 번역의도 구성 요소 수준의 활성 전사의 마커에 대한 특정 항체를 사용하여 보조 염색단백질로 변환되고, 새로 생성 된 RNA의 양의 표시를 제공하기 위해 기 기계들이 가능하다. 같은 굴지, 저산소증으로 크게 변경하지 않아야 단백질 등의 추가 단백질은 추가 컨트롤로 테스트 할 수 있습니다. 그것은 서로 다른 세포가 다른 RNA 합성 속도와 저산소증도 다른 반응이있을 것이다 가능성이 매우 높다 더욱이, 다른 세포 유형, 테스트 할 수 있습니다.

이 RNA 촬상 키트의 사용은 설명 된 단계들이 수행된다 제공 상당히 간단하다. 프로토콜의 중요한 단계는 세포 도금, 세포 고정과 염색 및 이미지 수집을 포함한다. 그것은 현저 결과에 영향을 미칠 것이다 실험에서 위로 또는 아래 합류 방지하는 바와 밀도로 세포를 플레이트에 중요하다. 그것은 촬영 셀의 가장 '스냅 샷'을 보장, 신선한 정착액을 사용하고 혈중 알코올 농도를 줄이기 위해 염색 한 후 세포를 세척 할 때 조심하는 것이 중요하다효율적인 분석을 위해 허용되는 수준으로 kground. 마지막으로, 이미지 수집의 방법은 이후의 분석을 위해 충분히 좋은 품질의 이미지를 달성하기 위해 매우 중요합니다. 우리는 광학 등 전 세계적으로 가장 연구 집약적 센터에서 사용할 수 있습니다이 프로토콜에 사용되는 현미경으로 샘플을 검사하는 데 사용할 수있는 최고의 광학 현미경을 사용하는 것이 좋습니다.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JB는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 박사 과정 학생, SR 연구소는 CRUK 수석 연구 활동 (C99667/A12918)에 의해 투자되는 바와 같이, CRUK 임상 동료입니다. 이 작품은 두 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 전략 포상 (097945/B/11/Z 및 095931/Z/11/Z)에 의해 지원되었다.

Materials

U-2 OS Primary Cells European Collection of Cell Cultures 92022711 http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true
PBS Gibco 14190094 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094
DMEM Gibco 41966029 https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029
FCS Gibco 10270106 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106
Penicillin/Streptomycin Lonza DE17-603E http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx
L-Glutamine Lonza BE17-605E http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx
0.05% Trypsin-EDTA (1%) Gibco 25300062 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062
Hypoxia Chamber Ruskinn InVivo2 300 http://www.ruskinn.com/products/invivo2300
Click-iT assay Kit Invitrogen C-10329/C10330 http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=601107&filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D
pFA Sigma 76240 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&region=GB
Triton X-100 Sigma X-100 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&region=GB
10M NaOH Sigma 72068 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&region=GB
37% HCl VWR 20252.335 https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or
VectaShield Mounting Medium Vector Laboratories H-1400 http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483
Actinomycin D Sigma A9415 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&region=GB
Deltavision Core Microscope Applied Precision N/A http://www.appliedprecision.com/
softWoRx [Refered to in text as image processing software] Applied Precision N/A http://www.api.com/softworx.asp
CoolSnap HQ2 CCD Camera Photometrics N/A http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php
Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software] OME N/A http://openmicroscopy.org/
SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software] Systat Software Inc. N/A http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php
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Single Cell AnalysisRNA SynthesisHypoxiaOxygen SensingTranscriptional ResponseCancer CellsMicroscopy AnalysisClick-iT RNA Imaging

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Citer Cet Article
Biddlestone, J., Druker, J., Shmakova, A., Ferguson, G., Swedlow, J. R., Rocha, S. Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia. J. Vis. Exp. (87), e51420, doi:10.3791/51420 (2014).
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