Se describe una técnica para el análisis de la síntesis del ARN mundial en la hipoxia utilizando imágenes. Click-química etiquetado de ARN previamente no se ha realizado en condiciones de hipoxia y permite la visualización de los cambios globales en el nivel de ARN de una sola célula. Este enfoque complementa las técnicas de ARN promediados existentes, lo que permite la visualización directa de célula a célula de los cambios en la síntesis de ARN mundial.
La hipoxia o disminución de la disponibilidad de oxígeno está involucrado en muchos procesos fisiológicos y patológicos. A nivel molecular, las células inician un programa transcripcional particular, con el fin de montar una respuesta celular apropiada y coordinada. La célula posee varias enzimas sensor de oxígeno que requieren oxígeno molecular como cofactor para su actividad. Estos van desde prolil-hidroxilasas a desmetilasas histonas. La mayoría de los estudios de análisis de las respuestas celulares a la hipoxia se basan en poblaciones celulares y estudios medios, y, como tal, el análisis de células individuales de células hipóxicas se realiza rara vez. Aquí se describe un método de análisis de la síntesis del ARN mundial a nivel de célula única en la hipoxia mediante el uso de kits de imagen RNA Click-iT en una estación de trabajo de oxígeno controlado, seguido por análisis de microscopía y cuantificación. El uso de células cancerosas expuestas a hipoxia durante diferentes periodos de tiempo, el ARN se marca y se mide en cada célula. Este análisis permitela visualización de los cambios temporales y de célula a célula en la síntesis de ARN mundial siguientes estrés hipóxico.
La hipoxia (bajas tensiones de oxígeno) ocurre cuando se altera el normal abastecimiento de oxígeno a un tejido. Oxígeno ambiental es tanto un nutriente y una molécula de señalización, proporcionando señales importantes para muchos tipos de células. Los cambios en oxígeno del medio ambiente son detectadas por un grupo de dioxigenasas que controlan la actividad de una familia de factores de transcripción esencial conocido como los factores inducibles por hipoxia (HIF). Los HIF están compuestos de dos subunidades, α y β. Hay tres isoformas conocidas de HIF-α (1, 2, y 3) y múltiples variantes de empalme de HIF-1β. HIF-1β se expresa constitutivamente y no regulada por los niveles de oxígeno del medio ambiente 1. Los miembros de la familia HIF-α se regulan dinámicamente por una clase de prolil-hidroxilasas (doctores) y el factor de inhibición de HIF (FIH); ambos de los cuales requieren oxígeno como un co-factor para catalizar la hidroxilación de HIF-α 2,3. En normoxia los miembros de la familia HIF-α son hidroxilados y etiquetados para proteosomAl degradación por la E3-ligasa, de von Hippel Lindau (VHL). En la hipoxia los doctores y FIH son inactivos o tienen una actividad reducida. Las isoformas HIF-α se estabilizan, forman un heterodímero con HIF-1β, y efectuar la transcripción de genes que proporcionan la respuesta celular al entorno hipóxico (Figura 1A) 4.
Las técnicas actuales para el análisis de ARN se centran en la cuantificación de los valores promediados a través de una población de células dada. Las células responden a un estímulo hipóxico mediante el inicio de la transcripción de un gran número de genes que les permiten adaptarse a su ambiente hostil 5. Sin embargo, la hipoxia menudo existe como un gradiente, y las células en un ambiente hipóxico no están sujetos a un estímulo hipóxico uniforme. Se describe una implementación de los kits de imagen RNA Click-iT en una estación de trabajo de oxígeno controlado para examinar la síntesis del ARN mundial a nivel de células individuales en la hipoxia.
El kit de imagen utiliza un ARN de unanucleósido lkyne modificado-, 5-etinil uridina (UE) y la ligadura quimioselectiva para permitir la detección de la síntesis del ARN mundial temporal y espacialmente en las células y tejidos 6. Brevemente, las células se tratan con la hipoxia y se cultivaron en la presencia de la UE. A continuación se fijan y se permeabilizaron y la incorporación de la UE en el ARN naciente se detecta mediante ligación quimioselectiva de la UE con un colorante que contiene azida. Un flujo de trabajo típico para esta reacción se muestra en la Figura 1B. Se utilizó el kit de imagen de ARN para examinar la síntesis de ARN en el nivel de células individuales que resultó de tratamiento con la hipoxia.
El pequeño tamaño de la etiqueta alquino permite la incorporación eficiente de la nucleósido modificado en ARN específicamente. La ligadura quimioselectiva o "clic" reacción es altamente eficiente, rápida y específica 7-10. Todos los componentes de la reacción son bioinerte y la reacción no requiere de temperaturas extremas o disolventes. La reacción click niegael requisito para el marcado radiactivo convencional y permite la visualización directa de los resultados ya que la salida es la luz. Además, la molécula de detección puede penetrar fácilmente en muestras complejas que permiten para el análisis múltiplex incluyendo anticuerpos para la detección de proteínas de ARN-interactivo. Este ensayo de formación de imágenes de ARN es compatible con colorantes orgánicos incluyendo Alexa Fluor y de fluoresceína (FITC).
Se midió el cambio en la síntesis de ARN después del tratamiento de las células usando una implementación del medio ambiente microscopía abierto para objetos remotos (OMERO). OMERO es un software de código abierto, disponible en http://openmicroscopy.org/ . Este software microscopio de imagen de visualización y análisis permite el acceso a, y el uso de una amplia gama de datos biológicos, incluida la gestión de bases de datos heterogéneas, multidimensionales. La aplicación cliente permite la visualización y el análisis de datos de imágenes biológicas complejas 11 a distancia;lo usamos para cuantificar los cambios visuales en la síntesis global y única de ARN celular. Estos datos y los pasos necesarios para analizar nuestro experimento de formación de imágenes de ARN usando este microscopio imagen software de visualización y análisis se muestran a continuación.
Nos fijamos en los cambios en la síntesis de ARN mundial después del tratamiento del osteosarcoma humano U2OS células (hipoxia), con capacidad para 24 hr. En todas las condiciones, se detectó la variación de célula a célula en el nivel de producción de ARN. Tiempos cortos de exposición a la hipoxia no dio lugar a cambios significativos en el nivel de ARN naciente en las células. Sin embargo, la exposición a 24 h de hipoxia resultó en un aumento significativo en la cantidad de ARN producido en las células. La mayoría de las respuestas celulares a la hipoxia se miden después de períodos prolongados de exposición, tales como 4 a 24 horas. Sin embargo, algunos mecanismos se ponen en marcha mucho antes, por ejemplo; La activación de NF-kB se produce dentro de 5-15 minutos de exposición a la hipoxia 12. La investigación de hipo más cortoPor lo tanto, los tiempos de exposición xia está garantizado y podría menoscabar las respuestas más complicados como el ciclo celular y la apoptosis.
Hemos descrito el uso de un kit de imagen de ARN para examinar los efectos de la hipoxia en la síntesis de ARN en células U2OS (osteosarcoma). Esta técnica es relativamente sencillo y proporciona datos acerca de la transcripción global a un nivel de células individuales. Hemos modificado el protocolo convencional para este kit para incorporar el etiquetado en una cámara de hipoxia. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe del uso de esta técnica para medir los cambios en la síntesis de ARN en la hipoxia. El kit de imagen RNA se utilizó es adecuado para la experimentación en la hipoxia, ya que no requiere de isótopos radiactivos y es técnicamente compatibles con las limitaciones de trabajar en una estación de trabajo de atmósfera controlada. Problemas comunes con esta técnica preocupación fijación y el etiquetado de la muestra eficiente. Es extremadamente importante que la PFA utiliza para fijar la muestra es fresca y las etapas de lavado que siguen la reacción "clic" se realizó como se describió para asegurar bajo la tinción de fondo de la muestra. Si background fluorescencia se convierte en un problema, se recomienda lavar una vez más con las imágenes de ARN 1 ml de tampón de lavado reacción kit después de la etapa 2.7.4.
El kit de imagen ARN mencionado aquí representa un avance significativo en la tecnología de imágenes de ARN en términos de facilidad de uso y especificidad y la velocidad de reacción. Esta técnica está limitada principalmente por el tiempo que toma para etiquetar la muestra. El kit de imagen ARN requiere de un período de marcado 1 hr que impide el examen de los rápidos cambios en el ARN mundial que suele ocurrir dentro de este plazo. Es por esta razón nuestro punto primera vez que se limita a 1 h y 15 min. La técnica está asociado con algunas otras limitaciones que se relacionan en gran medida el agente reactivo, la compatibilidad con otros marcadores fluorescentes, por ejemplo, este kit de imagen de ARN no es compatible con tinción faloidina.
Todos los enfoques existentes de estudio de la síntesis de ARN en las células se basan en la incorporación de nucleósidos modificados en laARN naciente y la detección de etiquetas incorporadas por diferentes medios. El enfoque innovador se basa en el uso de precursores de ARN marcadas radiactivamente seguido por la detección con autorradiografía. Este método dio lugar a un descubrimiento de las fases del ciclo celular y otros hallazgos importantes; sin embargo, tiene una gran cantidad de inconvenientes tales como la lentitud de los trabajos radiactividad, largos tiempos de exposición y las imágenes de baja resolución de autorradiografía 6. El siguiente avance en el campo explotado medio de inmunoquímica para eliminar la necesidad de radiactividad. ARN se marcó mediante la incorporación de BrU seguido de la detección inmunoquímica. Sin embargo, el anticuerpo unión eficiente requiere la desnaturalización de ácido nucleico para mejorar el acceso a ADN o ARN que causó la pérdida de la morfología celular y daña los epítopos de muchas proteínas, la prevención de su aún más la detección con anticuerpos marcados con fluorescencia 13. La introducción de la tecnología "click química 'simplifica la etapa de detección y tl procedimiento en comparación con autorradiografía e inmunoquímica. La tecnología se basa en azida-alquino reacción de cicloadición de Huisgen donde alquino terminal de 5-ethyniluridine se une con azida conjugado con el fluoróforo en presencia de Cu (I). La reacción es específica, rápida, no requiere ningún paso adicional, y es fácilmente compatible con la detección inmunoquímica de otros constituyentes celulares.
Utilizando esta tecnología de formación de imágenes de ARN que mostraron que las células, en la misma población monocapa, tienen diferentes niveles de la síntesis de ARN en respuesta a la hipoxia. Hemos restringido nuestro experimento para examinar el efecto de la única producción de ARN; Sin embargo, es totalmente posible con este kit de imagen de ARN para realizar modificados, reacciones múltiplex adicionales que permiten un análisis más complejo de la producción de ARN. Por ejemplo, la tinción secundaria usando un anticuerpo específico para los marcadores de la transcripción activa tales como los niveles de fosforilados ARN polimerasa II o incluso componentes de la tramaquinaria ción para dar una indicación de la cantidad de este ARN recién producido que se convierte en proteína son posibles. Proteínas adicionales, tales como actina, una proteína que no debe cambiar significativamente con la hipoxia, podrían probarse como un control adicional. Además, diferentes tipos de células podrían ser probados, ya que es muy probable que diferentes células tienen diferentes tasas de síntesis de ARN e incluso respuestas diferentes a la hipoxia.
El uso de este kit de imagen de ARN es bastante sencillo siempre que los pasos se realizaron como se describe. Los pasos críticos en el protocolo implican chapado celular, la fijación de células y la tinción y la adquisición de imágenes. Es importante a la placa las células a la densidad descrito para prevenir la sobre o debajo de confluencia en la experimentación que afectará de manera significativa el resultado. También es importante usar fijador fresco, lo que garantiza el mejor "instantánea" de la celda se toma y tener cuidado al lavado de las células después de la tinción de reducir la tasa de alcoholemiakground a un nivel que es aceptable para el análisis eficiente. Por último, el método de adquisición de la imagen es de vital importancia para lograr imágenes que son de una buena calidad suficiente para su posterior análisis. Le recomendamos que utilice el mejor microscopio de luz disponible para examinar muestras ópticamente como el microscopio usado en este protocolo que está disponible en la mayoría de los centros de investigación intensiva a nivel mundial.
The authors have nothing to disclose.
JB es un miembro clínico CRUK, AS es un estudiante de doctorado Wellcome Trust, el laboratorio de SR es financiado por una Beca de Investigación Superior CRUK (C99667/A12918). Este trabajo fue apoyado por dos premios Strategic Wellcome Trust (097945/B/11/Z y 095931/Z/11/Z).
U-2 OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true | |
PBS | Gibco | 14190094 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029 | |
FCS | Gibco | 10270106 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106 | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | DE17-603E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx | |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx | |
0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062 | |
Hypoxia Chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 | |
Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=601107&filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D | |
pFA | Sigma | 76240 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en®ion=GB | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en®ion=GB | |
10M NaOH | Sigma | 72068 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en®ion=GB | |
37% HCl | VWR | 20252.335 | https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or | |
VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483 | |
Actinomycin D | Sigma | A9415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en®ion=GB | |
Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | http://www.appliedprecision.com/ | |
softWoRx [Refered to in text as image processing software] | Applied Precision | N/A | http://www.api.com/softworx.asp | |
CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php | |
Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software] | OME | N/A | http://openmicroscopy.org/ | |
SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software] | Systat Software Inc. | N/A | http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php |