Vi beskriver en teknikk for analyse av global RNA syntese i hypoksi ved hjelp av bildebehandling. Klikk-kjemi merking av RNA har ikke tidligere blitt utført under hypoksi og tillater visualisering av globale RNA endringer på celle-nivå. Denne tilnærmingen utfyller de eksisterende gjennomsnitt RNA teknikker, som tillater direkte visualisering av celle-til-celle endringer i global RNA-syntese.
Hypoksi eller senking av oksygen tilgjengelighet er involvert i mange fysiologiske og patologiske prosesser. På molekylært nivå, celler i gang en bestemt transcriptional program for å montere en hensiktsmessig og koordinert cellulær respons. Cellen besitter flere oksygen sensor enzymer som krever molekylært oksygen som kofaktor for sin aktivitet. Disse spenner fra prolyl-hydroksylaser til histone demethylases. Flertallet av studiene analysere cellulære responser til hypoksi er basert på cellepopulasjoner og gjennomsnittlig studier, og som sådan enkelt celle analyse av hypoksiske celler blir sjelden utført. Her beskriver vi en fremgangsmåte for analyse av global RNA-syntesen på celle-nivået i hypoksi ved hjelp Click-iT RNA bildesett i en oksygen kontrollert arbeidsstasjon, etterfulgt av mikroskopi-analyse og kvantifisering. Ved hjelp av kreftceller som er utsatt for hypoksi for forskjellige lengder av tid, blir RNA-merket og målt i hver celle. Denne analysen kanvisualisering av tidsmessige og celle-til-celle endringer i global RNA syntese følgende hypoksisk stress.
Hypoksi (lavt oksygen spenninger) oppstår når den normale oksygentilførsel til et vev blir forstyrret. Miljømessig oksygen er både et næringsstoff, og et signalmolekyl, som gir viktige signaler for mange celletyper. Endringer i miljø oksygen blir detektert av en gruppe dioxygenases som kontrollerer aktiviteten av en vesentlig transkripsjonsfaktor familie kjent som Hypoksi Induserbare Factors (HIFs). De HIFs er sammensatt av to subenheter, α-og β. Det er tre kjente isoformer av HIF-α (1, 2 og 3) og flere spleisevarianter av HIF-1β. HIF-1β er konstitutivt uttrykt og ikke regulert av miljømessige oksygennivå 1. De HIF-α familiemedlemmer er dynamisk regulert av en klasse av prolyl-hydroksylaser (doktorgrad) og Factor Hemme HIF (FIH); som begge krever oksygen som en ko-faktor for å katalysere hydroksylering av HIF-α 2,3. I normoksiske de HIF-α familiemedlemmer er hydroksyleres og merket for proteosomal degradering av E3-Ligase, von Hippel Lindau (VHL). I hypoksi doktorene og FIH er inaktive eller har en redusert aktivitet. HIF-α-isoformer blitt stabilisert, danner en heterodimer med HIF-1β, og bevirke transkripsjon av gener som gir den cellulære respons på hypoksisk miljø (figur 1A) 4..
Nåværende teknikker for RNA-analyse fokusere på kvantifisering av gjennomsnittsverdier over en gitt cellepopulasjon. Celler svare på en stimulus hypoksisk ved å initiere transkripsjon av en myriade av gener som tillater dem å tilpasse seg fiendtlig miljø 5. Men ofte finnes hypoksi som en gradient, og celler i et hypoksisk miljø er ikke underlagt en enhetlig hypoksisk stimulans. Vi beskriver en implementering av den klikk iT RNA bildebehandlingssett i en oksygen styrt arbeidsstasjon å undersøke global RNA syntese på celle-nivå i hypoksi.
RNA bildebehandlingssettet bruker en enlkyne-modifisert nukleosid, 5-etynyl-uridin (EU) og chemoselective ligering for å muliggjøre deteksjon av global RNA syntese i tid og rom i celler og vev 6. Kort fortalt blir celler behandlet med hypoksi og dyrket i nærvær av EU. De blir deretter fast og permeabilized og EU innlemmelse i begynnende RNA blir oppdaget av chemoselective ligation av EU med en azid inneholder fargestoff. En typisk arbeidsflyt for denne reaksjon er vist i figur 1B. Vi brukte RNA bildebehandlingssettet å undersøke RNA syntese på celle-nivå som resulterte fra behandling med hypoksi.
Den lille størrelsen av alkynet tag muliggjør effektiv inkorporering av det modifiserte nukleosid til RNA spesifikt. Den chemoselective ligation eller 'klikk' reaksjon er svært effektiv, rask og bestemt 7-10. Alle reaksjonskomponenter er bioinert og reaksjonen krever ingen ekstreme temperaturer eller oppløsningsmidler. Klikket reaksjon negererkravet til konvensjonelle radiomerking og tillater direkte visualisering av resultater, siden utgangen er lys. I tillegg, kan deteksjonsmolekyl lett trenge komplekse prøver slik at for multiplex-analyse, inkludert antistoffer for påvisning av RNA-interaktive proteiner. Dette RNA bildebehandling analysen er kompatibel med organiske fargestoffer inkludert Alexa Fluor og fluorescein (FITC).
Vi målte endringen i RNA-syntese etter behandling av cellene ved hjelp av en implementering av den åpne mikros miljø for fjerntliggende objekter (OMERO). OMERO er open-source programvare, tilgjengelig på http://openmicroscopy.org/ . Dette mikroskop bilde visualisering og analyse programvare gir tilgang til, og bruk av et bredt spekter av biologiske data, herunder forvaltning av flerdimensjonale, heterogene datasettene. Klientprogrammet tillater ekstern visualisering og analyse av komplekse biologiske bildedata 11;vi brukte den til å kvantifisere de visuelle endringer i global og enkelt celle RNA-syntese. Disse data og trinnene som kreves for å analysere vår RNA bildebehandling eksperiment ved hjelp av denne mikroskop bilde visualisering og analyse programvare er vist nedenfor.
Vi så på endringer i global RNA syntese etter behandlingen av menneskelige osteosarkom (U2OS) celler med hypoksi i opptil 24 timer. I alle forhold, har vi oppdaget at celle-til-celle variasjon i nivået av RNA-produksjon. Korte perioder med hypoksi eksponering førte ikke til vesentlige endringer i nivået av begynnende RNA i cellene. Imidlertid utsettes for 24 timers av hypoksi resulterte i en betydelig økning i mengden av RNA produsert i cellene. De fleste av de cellulære responser til hypoksi måles etter lengre perioder med eksponering, for eksempel 4-24 timer. Imidlertid er noen mekanismer settes på plass mye tidligere, for eksempel; NF-κB aktivering skjer innen 5-15 min av hypoksi eksponering 12. Gransker kortere hypoXia eksponeringstider er derfor berettiget og kan ta oppmerksomheten vekk fra mer kompliserte tiltak som for eksempel cellesyklus og apoptose.
Vi har beskrevet bruken av et RNA avbildningssettet for å undersøke virkningen av hypoksi for RNA-syntese i osteosarkom (U2OS) celler. Denne teknikken er relativt enkel og gir data om global transkripsjon ved en enkelt celle nivå. Vi endret den konvensjonelle protokollen for dette settet for å innlemme merking i en hypoksi kammer. Så vidt vi vet er dette den første rapport om anvendelse av denne teknikken for å måle endringer i RNA-syntese i hypoksi. RNA bildebehandlingssettet vi brukte er egnet for eksperimentering i hypoksi siden det krever ingen radioaktive isotoper og er teknisk kompatibel med begrensningene av å jobbe i en kontrollert atmosfære arbeidsstasjon. Vanlige problemer med denne teknikken bekymring effektiv fiksering og merking av prøven. Det er ekstremt viktig at PFA brukes til å fikse prøven er frisk og vasketrinnet som følger den "klikk" reaksjon utføres som beskrevet for å sikre lav bakgrunnsfarging av prøven. Hvis background fluorescens blir et problem, anbefales det å vaske en gang til med en ml RNA bildebehandlingssett reaksjon skylle buffer etter trinn 2.7.4.
RNA bildebehandlingssettet nevnt her representerer et betydelig fremskritt i RNA bildeteknologi i form av brukervennlighet og spesifisitet og hastigheten på reaksjonen. Denne teknikk er i første rekke begrenset av tiden det tar å merke prøven. RNA bildebehandlingssett krever en hr merking periode som hindrer undersøkelse av raske endringer i global RNA som vanligvis ville oppstå innenfor denne tidsrammen. Det er av denne grunn vår første tidspunkt er begrenset til 1 time og 15 min. Teknikken er forbundet med noen andre begrensninger som i stor grad er knyttet til reagensrom kompatibilitet med andre fluorescerende markører, for eksempel, er ikke kompatibel med phalloidin flekker dette RNA bildebehandlingssettet.
Alle eksisterende metoder for å studere RNA-syntese i cellene er basert på inkorporering av modifiserte nukleosider inn i detbegynnende RNA og påvisning av innlemmet etiketter med ulike virkemidler. Den banebrytende tilnærming var basert på bruk av radioaktivt merket RNA forløpere fulgt av deteksjon med autoradiografi. Denne metoden førte til et funn av cellesyklusfaser og andre viktige funn; Men, den har en masse ulemper som tungvint natur radioaktivitet arbeid, lange eksponeringstider og lav oppløsning bilder av autoradiografi seks. Den neste fremskritt innenfor området utnyttes hjelp av immunkjemi for å eliminere nødvendigheten av radioaktivitet. RNA ble merket ved inkorporering av BRU, etterfulgt av immunologisk kjemisk påvisning. Imidlertid effektiv antistoffbinding kreves nukleinsyre denaturering for å forbedre tilgangen til DNA eller RNA som skyldes tap av celle-morfologi og skadet epitopene av mange proteiner, forhindrer deres videre deteksjon med fluorescensmerkede antistoffer 13. Innføringen av "klikk kjemi 'teknologi forenklet deteksjonstrinnet og tHan prosedyre i forhold til autoradiografi og immunkjemi. Teknologien er basert på azid-alkynet Huisgen cycloaddition reaksjon hvor terminal alkynet av 5-ethyniluridine bindes med azid konjugert med fluoroforen i nærvær av Cu (I). Reaksjonen er spesifikk, rask og ikke krever noen ytterligere trinn, og det er lett forenlig med immunokjemisk påvisning av andre cellebestanddeler.
Ved å bruke denne RNA avbildningsteknologi vi viste at cellene i den samme monolayer populasjon, har forskjellige RNA syntese nivåer i respons til hypoksi. Vi begrenset vår eksperiment for å undersøke effekten av RNA produksjon bare; Det er imidlertid helt mulig med denne RNA avbildningssett for å utføre modifiserte, videre multipleks reaksjoner som gir mulighet for en mer kompleks analyse av RNA-produksjon. For eksempel, sekundære flekker ved hjelp av et antistoff som er spesifikke for markører av aktiv transkripsjon som nivået av fosforylert RNA polymerase II, eller til og med komponenter av omregsjon maskineri for å gi en indikasjon på mengden av dette nylig produserte RNA som blir omdannet til protein er mulig. Andre proteiner, slik som Actin, et protein som ikke skal endres vesentlig med hypoksi, kan testes som en ytterligere kontroll. Videre kan ulike celletyper testes, så det er svært sannsynlig at ulike celler vil ha ulike RNA-syntese priser og med ulike reaksjoner på hypoksi.
Ved å bruke denne RNA avbildningssettet er ganske enkelt gitt trinnene blir utført som beskrevet. Kritiske trinn i protokollen innebærer celle plating, celle fiksering og farging og bilde oppkjøpet. Det er viktig å plate cellene ved den beskrevne tetthet for å forhindre over-eller underløpet ved eksperimentering som vil påvirke resultatet. Det er også viktig å bruke frisk fiksativ, som sikrer den beste "snapshot" av cellen er tatt og for å ta vare når du vasker cellene etter farging å redusere background til et nivå som er akseptabelt for effektiv analyse. Til slutt, er den fremgangsmåte for bildeopptak av vital betydning for å oppnå bilder som er av en god nok kvalitet for etterfølgende analyse. Vi anbefaler at du bruker den beste lysmikroskop tilgjengelig for å undersøke prøver optisk som mikroskopet brukes i denne protokoll som er tilgjengelig på de fleste forskningsintensive sentre globalt.
The authors have nothing to disclose.
JB er en CRUK klinisk stipendiat, AS er et Wellcome Trust Stipendiat, SR lab er finansiert av en CRUK Seniorforsker Fellowship (C99667/A12918). Dette arbeidet ble støttet av to Wellcome Trust Strategiske Awards (097945/B/11/Z og 095931/Z/11/Z).
U-2 OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true | |
PBS | Gibco | 14190094 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029 | |
FCS | Gibco | 10270106 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106 | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | DE17-603E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx | |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx | |
0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062 | |
Hypoxia Chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 | |
Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=601107&filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D | |
pFA | Sigma | 76240 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en®ion=GB | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en®ion=GB | |
10M NaOH | Sigma | 72068 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en®ion=GB | |
37% HCl | VWR | 20252.335 | https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or | |
VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483 | |
Actinomycin D | Sigma | A9415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en®ion=GB | |
Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | http://www.appliedprecision.com/ | |
softWoRx [Refered to in text as image processing software] | Applied Precision | N/A | http://www.api.com/softworx.asp | |
CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php | |
Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software] | OME | N/A | http://openmicroscopy.org/ | |
SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software] | Systat Software Inc. | N/A | http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php |