Hypoxia निम्नलिखित एकल कोशिका के स्तर पर ग्लोबल शाही सेना संश्लेषण का विश्लेषण
Summary
हम इमेजिंग का उपयोग हाइपोक्सिया में वैश्विक शाही सेना संश्लेषण के विश्लेषण के लिए एक तकनीक का वर्णन. शाही सेना के क्लिक रसायन लेबलिंग पहले हाइपोक्सिया के तहत प्रदर्शन किया और एकल कोशिका के स्तर पर वैश्विक शाही सेना परिवर्तन के दृश्य की अनुमति देता नहीं किया गया है. यह दृष्टिकोण वैश्विक शाही सेना संश्लेषण में सेल करने वाली सेल परिवर्तन के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति, मौजूदा औसतन आरएनए तकनीक पूरक.
Abstract
ऑक्सीजन की उपलब्धता की hypoxia या कम करने के कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में शामिल किया जाता है. आणविक स्तर पर, कोशिकाओं एक उपयुक्त और समन्वित सेलुलर प्रतिक्रिया माउंट करने के क्रम में एक विशेष transcriptional कार्यक्रम आरंभ. सेल उनकी गतिविधियों के लिए cofactor के रूप में आणविक ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है कि कई ऑक्सीजन सेंसर एंजाइमों के पास. ये prolyl-hydroxylases से histone demethylases को लेकर. हाइपोक्सिया के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण अध्ययन के बहुमत सेलुलर आबादी और औसत अध्ययन पर आधारित हैं, और hypoxic कोशिकाओं की एकल कोशिका विश्लेषण के रूप में शायद ही कभी किया जाता है. यहाँ हम माइक्रोस्कोपी विश्लेषण और मात्रा का ठहराव जिसके बाद ऑक्सीजन नियंत्रित कार्य केंद्र में क्लिक करें, यह आरएनए इमेजिंग किट का उपयोग करके हाइपोक्सिया में एकल कोशिका के स्तर पर वैश्विक शाही सेना संश्लेषण के विश्लेषण की विधि का वर्णन है. समय के विभिन्न लंबाई के लिए हाइपोक्सिया के संपर्क में कैंसर कोशिकाओं का प्रयोग, आरएनए प्रत्येक कक्ष में लेबल और मापा जाता है. इस विश्लेषण की अनुमति देता हैhypoxic तनाव निम्न वैश्विक शाही सेना संश्लेषण में लौकिक और सेल करने वाली सेल परिवर्तन के दृश्य.
Introduction
हाइपोक्सिया (कम ऑक्सीजन तनाव) एक ऊतक को सामान्य ऑक्सीजन की आपूर्ति से परेशान है जब होती है. पर्यावरण ऑक्सीजन कई प्रकार की कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण cues उपलब्ध कराने, एक पोषक तत्व और एक संकेत अणु दोनों है. पर्यावरण ऑक्सीजन में बदलाव Hypoxia inducible कारक (HIFs) के रूप में जाना एक आवश्यक प्रतिलेखन कारक परिवार की गतिविधि को नियंत्रित कि dioxygenases के एक समूह द्वारा महसूस कर रहे हैं. HIFs दो यूनिटों, α और β से बना रहे हैं. तीन ज्ञात HIF-α के isoforms (1, 2, और 3) और HIF-1β के कई ब्याह वेरिएंट हैं. HIF-1β रचनात्मक रूप में व्यक्त करने और पर्यावरण ऑक्सीजन का स्तर 1 द्वारा विनियमित नहीं है. HIF-α परिवार के सदस्यों को गतिशील prolyl-hydroxylases (छात्र पीएचडी) के एक वर्ग द्वारा विनियमित और फैक्टर HIF (एफआईएच) बाधा कर रहे हैं; HIF-α 2,3 के hydroxylation उत्प्रेरित करने के लिए एक सह कारक के रूप में ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है, जो दोनों के. Normoxia में HIF-α परिवार के सदस्यों hydroxylated रहे हैं और proteosom के लिए टैगE3-ligase, वॉन Hippel Lindau (VHL) द्वारा अल गिरावट. हाइपोक्सिया में छात्र पीएचडी करते हैं और एफआईएच निष्क्रिय हैं या एक कम गतिविधि है. HIF-α isoforms, स्थिर हो जाते हैं HIF-1β साथ एक heterodimer फार्म, और hypoxic पर्यावरण (चित्रा 1 ए) के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया प्रदान जीन है कि प्रतिलेखन प्रभाव 4.
शाही सेना के विश्लेषण के लिए वर्तमान तकनीकों एक दिया सेल आबादी में औसतन मूल्यों की मात्रा का ठहराव पर ध्यान केंद्रित. कोशिकाओं उन्हें उनके शत्रुतापूर्ण वातावरण 5 के लिए अनुकूल करने की अनुमति है कि जीन की एक बहुत बड़ी संख्या के प्रतिलेखन शुरू करके एक hypoxic उत्तेजना का जवाब. हालांकि, हाइपोक्सिया अक्सर एक ढाल के रूप में मौजूद है, और एक hypoxic वातावरण में कोशिकाओं को एक समान hypoxic प्रोत्साहन के अधीन नहीं हैं. हम हाइपोक्सिया में एकल कोशिका के स्तर पर वैश्विक शाही सेना संश्लेषण की जांच के लिए एक ऑक्सीजन नियंत्रित कार्य केंद्र में क्लिक करें, यह आरएनए इमेजिंग किट के एक कार्यान्वयन का वर्णन है.
शाही सेना इमेजिंग किट एक एक का उपयोग करता हैlkyne संशोधित न्यूक्लीओसाइड, 5 ethynyl uridine (ईयू) और कोशिकाओं और ऊतकों 6 में अस्थायी और स्थानिक वैश्विक शाही सेना संश्लेषण का पता लगाने के लिए सक्षम करने के chemoselective बंधाव. संक्षेप में, कोशिकाओं हाइपोक्सिया और यूरोपीय संघ की उपस्थिति में सुसंस्कृत के साथ व्यवहार कर रहे हैं. वे तो तय है और permeabilized और नवजात शाही सेना में यूरोपीय संघ के निगमन एक azide युक्त डाई के साथ यूरोपीय संघ के chemoselective बंधाव से पता चला है रहे हैं. इस प्रतिक्रिया के लिए एक विशिष्ट कार्यप्रवाह चित्रा 1 बी में दिखाया गया है. हम हाइपोक्सिया के साथ इलाज से हुई कि एकल कोशिका के स्तर पर शाही सेना संश्लेषण की जांच करने के लिए शाही सेना इमेजिंग किट का इस्तेमाल किया.
alkyne टैग के छोटे आकार के लिए विशेष रूप से शाही सेना में संशोधित न्यूक्लीओसाइड के कुशल समावेश सक्षम बनाता है. chemoselective बंधाव या 'क्लिक' प्रतिक्रिया अत्यधिक कुशल, तेज और 7-10 विशिष्ट है. प्रतिक्रिया घटकों के सभी bioinert हैं और प्रतिक्रिया नहीं अत्यधिक तापमान या विलायकों की आवश्यकता है. क्लिक करें प्रतिक्रिया नकारतीपारंपरिक radiolabelling के लिए आवश्यकता और उत्पादन के बाद से परिणाम के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है प्रकाश है. इसके अलावा, पता लगाने के अणु आसानी आरएनए इंटरैक्टिव प्रोटीन का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी सहित मल्टीप्लेक्स विश्लेषण के लिए अनुमति जटिल नमूने घुसना कर सकते हैं. इस शाही सेना इमेजिंग परख एलेक्सा Fluor और fluorescein (FITC) सहित कार्बनिक रंगों के साथ संगत है.
हम दूरस्थ वस्तुओं के लिए खुला माइक्रोस्कोपी पर्यावरण (OMERO) के एक कार्यान्वयन का उपयोग हमारी कोशिकाओं के इलाज के बाद शाही सेना संश्लेषण में परिवर्तन मापा. OMERO पर उपलब्ध खुला स्रोत सॉफ्टवेयर, है http://openmicroscopy.org/ . इस माइक्रोस्कोप छवि दृश्य और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग, और बहुआयामी, विषम डेटासेट के प्रबंधन सहित जैविक डेटा की एक विस्तृत श्रृंखला, के उपयोग में सक्षम बनाता है. ग्राहक आवेदन दूरदराज के दृश्य और जटिल जैविक छवि डेटा 11 के विश्लेषण की अनुमति देता है;हम वैश्विक और एकल कक्ष शाही सेना संश्लेषण में दृश्य परिवर्तन यों तो इसका इस्तेमाल किया. इस माइक्रोस्कोप छवि दृश्य और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इन आंकड़ों और हमारे शाही सेना इमेजिंग प्रयोग का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक कदम नीचे दिखाई जाती हैं.
हम 24 घंटे के लिए हाइपोक्सिया के साथ मानव osteosarcoma का उपचार (U2OS) कोशिकाओं का एक वैश्विक शाही सेना संश्लेषण में परिवर्तन देखा. सभी परिस्थितियों में, हम आरएनए उत्पादन के स्तर में सेल करने वाली सेल भिन्नता का पता चला. हाइपोक्सिया जोखिम के कम समय कोशिकाओं में नवजात शाही सेना के स्तर में महत्वपूर्ण बदलाव में परिणाम नहीं था. हालांकि, हाइपोक्सिया के 24 घंटे के लिए जोखिम कोशिकाओं में उत्पादित शाही सेना की मात्रा में उल्लेखनीय वृद्धि हुई. हाइपोक्सिया के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं के अधिकांश 4-24 घंटे के रूप में जोखिम की लंबी अवधि, निम्न मापा जाता है. हालांकि, कुछ तंत्र उदाहरण के लिए, बहुत पहले जगह में डाल रहे हैं; NF-κB सक्रियण हाइपोक्सिया जोखिम 12 से 5-15 मिनट के भीतर होता है. कम हाइपो जांच करज़िया जोखिम बार इसलिए न्यायसंगत और इस तरह के सेल चक्र और apoptosis के रूप में और अधिक जटिल प्रतिक्रियाओं से इनकार भी कर सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम osteosarcoma (U2OS) कोशिकाओं में शाही सेना संश्लेषण पर हाइपोक्सिया के प्रभाव की जांच करने के लिए एक शाही सेना इमेजिंग किट के हमारे उपयोग का वर्णन किया है. इस तकनीक अपेक्षाकृत सरल है और एक एकल कोशिका के स्तर पर वैश्विक प्रतिलेखन के बारे में डेटा प्रदान करता है. हम एक हाइपोक्सिया कक्ष में लेबलिंग को शामिल करने के लिए इस किट के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल संशोधित. हमारे ज्ञान करने के लिए इस हाइपोक्सिया में शाही सेना संश्लेषण में परिवर्तन को मापने के लिए इस तकनीक का उपयोग की पहली रिपोर्ट है. यह कोई रेडियोधर्मी आइसोटोप की आवश्यकता है और एक नियंत्रित वातावरण कार्य केंद्र में काम करने की सीमाओं के साथ तकनीकी रूप से संगत है के बाद से हम इस्तेमाल शाही सेना इमेजिंग किट हाइपोक्सिया में प्रयोग के लिए उपयुक्त है. इस तकनीक चिंता कुशल निर्धारण और नमूना की लेबलिंग के साथ आम समस्याओं. यह पीएफए नमूना ताजा है और नमूना की कम पृष्ठभूमि धुंधला सुनिश्चित करने के रूप में वर्णित 'क्लिक' प्रतिक्रिया का पालन करें कि धोने कदम प्रदर्शन कर रहे हैं ठीक करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि अत्यंत महत्वपूर्ण है. बी हैंackground प्रतिदीप्ति यह कदम 2.7.4 के बाद 1 मिलीलीटर शाही सेना इमेजिंग किट प्रतिक्रिया कुल्ला बफर के साथ एक बार फिर से धोने के लिए सिफारिश की है एक समस्या बन जाता है.
यहां उल्लेख शाही सेना इमेजिंग किट का उपयोग करें और प्रतिक्रिया की विशिष्टता और गति में आसानी के मामले में शाही सेना इमेजिंग प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है. यह तकनीक मुख्य रूप से यह नमूना लेबल करने के लिए लगने वाले समय के द्वारा सीमित है. शाही सेना इमेजिंग किट आमतौर पर इस समय सीमा के भीतर घटित होता है कि वैश्विक शाही सेना में तेजी से बदलाव की परीक्षा रोकता है एक 1 घंटा लेबलिंग अवधि की आवश्यकता है. इस कारण हमारी पहली बार बिंदु 1 घंटा और 15 मिनट तक ही सीमित है यह है. तकनीक काफी हद तक उदाहरण के लिए, इस शाही सेना इमेजिंग किट Phalloidin धुंधला के साथ संगत नहीं है, अन्य फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ अनुकूलता अभिकर्मक से संबंधित कुछ अन्य सीमाओं के साथ जुड़ा हुआ है.
कोशिकाओं में शाही सेना संश्लेषण का अध्ययन के सभी मौजूदा दृष्टिकोण में संशोधित nucleosides के समावेश पर आधारित हैंनवजात शाही सेना और अलग अलग तरीकों से शामिल लेबल का पता लगाने. अग्रणी दृष्टिकोण autoradiography साथ पता लगाने के द्वारा पीछा radioactively लेबल शाही सेना व्यापारियों के प्रयोग पर आधारित था. इस विधि सेल चक्र चरणों और अन्य महत्वपूर्ण निष्कर्ष यह एक खोज हुई; हालांकि, यह इस तरह की रेडियोधर्मिता का काम है, लंबे समय जोखिम बार और autoradiography 6 के कम संकल्प छवियों के बोझिल प्रकृति के रूप में नुकसान का एक बहुत कुछ है. क्षेत्र में अगले अग्रिम रेडियोधर्मिता की आवश्यकता को समाप्त करने के लिए immunochemistry का साधन शोषण किया. शाही सेना immunochemistry का पता लगाने के द्वारा पीछा ब्रू के निगमन द्वारा चिह्नित किया गया. हालांकि, कुशल एंटीबॉडी डीएनए या सेल आकारिकी की क्षति हुई और fluorescently लेबल एंटीबॉडी 13 के साथ उनके आगे का पता लगाने को रोकने, कई प्रोटीन की epitopes क्षतिग्रस्त है कि शाही सेना के लिए उपयोग में सुधार करने के लिए न्यूक्लिक एसिड विकृतीकरण आवश्यक बाइंडिंग. 'क्लिक रसायन शास्त्र' प्रौद्योगिकी की शुरूआत का पता लगाने के कदम और टी सरलीकृतवह प्रक्रिया autoradiography और immunochemistry की तुलना में. प्रौद्योगिकी 5 ethyniluridine के टर्मिनल alkyne घन (आई) की उपस्थिति में fluorophore साथ संयुग्मित azide के साथ बांध जहां azide-alkyne Huisgen cycloaddition प्रतिक्रिया पर आधारित है. प्रतिक्रिया, तेजी से, विशिष्ट है किसी भी अतिरिक्त कदम की आवश्यकता नहीं है, और अन्य सेल घटकों के immunochemical पता लगाने के साथ आसानी से संगत है.
इस शाही सेना इमेजिंग तकनीक का उपयोग हम कोशिकाओं, एक ही monolayer आबादी में, हाइपोक्सिया के जवाब में अलग शाही सेना संश्लेषण का स्तर है कि दिखाया. हम आरएनए उत्पादन केवल के प्रभाव की जांच करने के लिए हमारे प्रयोग प्रतिबंधित; हालांकि, यह आरएनए उत्पादन का एक और अधिक जटिल विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं कि संशोधित, अतिरिक्त मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए इस शाही सेना इमेजिंग किट के साथ पूरी तरह से संभव है. उदाहरण के लिए, ऐसे phosphorylated शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय या transla के भी घटक के स्तर के रूप में सक्रिय प्रतिलेखन के मार्कर के लिए विशिष्ट एक एंटीबॉडी का उपयोग माध्यमिक धुंधलाप्रोटीन में बदल जाता है कि इस नव निर्मित शाही सेना की राशि का एक संकेत देने के लिए tion मशीनरी संभव हो रहे हैं. ऐसे actin, हाइपोक्सिया के साथ काफी परिवर्तन नहीं होना चाहिए कि एक प्रोटीन के रूप में अतिरिक्त प्रोटीन, एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में परीक्षण किया जा सकता है. यह विभिन्न कक्षों अलग शाही सेना संश्लेषण दरों और hypoxia के लिए भी अलग प्रतिक्रियाओं होगा बहुत संभावना है कि इसके अलावा, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का परीक्षण किया जा सकता है.
इस शाही सेना इमेजिंग किट के उपयोग के रूप में वर्णित चरणों का प्रदर्शन कर रहे हैं प्रदान की काफी सरल है. प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम सेल चढ़ाना, सेल निर्धारण और धुंधला हो जाना और छवि अधिग्रहण शामिल है. यह काफी परिणाम को प्रभावित करेगा जो प्रयोग पर पर या संगम के तहत रोकने के लिए वर्णित घनत्व पर कोशिकाओं थाली करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसे ले लिया है सेल का सबसे अच्छा 'स्नैपशॉट' सुनिश्चित करने, ताजा लगानेवाला का उपयोग करने के लिए और बीएसी को कम करने के धुंधला के बाद कोशिकाओं को धोने जब देखभाल करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैकुशल विश्लेषण के लिए स्वीकार्य है कि एक स्तर तक kground. अंत में, छवि अधिग्रहण की विधि बाद के विश्लेषण के लिए एक अच्छा पर्याप्त गुणवत्ता के हैं कि छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम ऑप्टिकली ऐसे में विश्व स्तर पर सबसे अधिक अनुसंधान गहन केन्द्रों पर उपलब्ध है, जो इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता माइक्रोस्कोप के रूप में नमूनों की जांच करने के लिए सबसे अच्छा उपलब्ध प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करना चाहिये.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जेबी एक वेलकम ट्रस्ट पीएचडी छात्र, एसआर प्रयोगशाला एक CRUK सीनियर रिसर्च फैलोशिप (C99667/A12918) द्वारा वित्त पोषित है, के रूप में एक CRUK नैदानिक साथी है. यह काम दो वेलकम ट्रस्ट सामरिक पुरस्कार (097945/B/11/Z और 095931/Z/11/Z) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| U-2 OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true | |
| PBS | Gibco | 14190094 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029 | |
| FCS | Gibco | 10270106 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | DE17-603E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062 | |
| Hypoxia Chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 | |
| Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=601107&filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D | |
| pFA | Sigma | 76240 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en®ion=GB | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en®ion=GB | |
| 10M NaOH | Sigma | 72068 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en®ion=GB | |
| 37% HCl | VWR | 20252.335 | https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or | |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483 | |
| Actinomycin D | Sigma | A9415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en®ion=GB | |
| Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | http://www.appliedprecision.com/ | |
| softWoRx [Refered to in text as image processing software] | Applied Precision | N/A | http://www.api.com/softworx.asp | |
| CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php | |
| Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software] | OME | N/A | http://openmicroscopy.org/ | |
| SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software] | Systat Software Inc. | N/A | http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php |
References
- Kenneth, N. S., Rocha, S. Regulation of gene expression by hypoxia. Biochem J. 414, 19-29 (2008).
- Appelhoff, R. J., et al. Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor. J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).
- Lancaster, D. E., et al. Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity. Biochem J. 383, 429-437 (2004).
- Rocha, S. Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription. Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).
- Schodel, J., et al. High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq. Blood. 117, (2011).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).
- Breinbauer, R., Kohn, M. Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry. Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).
- Wang, Q., et al. Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nat Methods. 9, 245-253 (2012).
- Culver, C., et al. Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB. Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).
- Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on “click chemistry. Cytometry A. 79, 328-337 (2011).
