Vi beskriver en teknik til analyse af den globale RNA-syntese i hypoxi hjælp billeddannelse. Click-kemi mærkning af RNA har ikke tidligere været udført under hypoxi og tillader visualisering af den globale RNA-ændringer på enkelt celle niveau. Denne tilgang supplerer den eksisterende gennemsnit RNA-teknikker, der muliggør direkte visualisering af celle-til-celle ændringer i den globale RNA-syntese.
Hypoxi eller sænkning af ilt tilgængelighed er involveret i mange fysiologiske og patologiske processer. På molekylært niveau celler indlede en bestemt transkriptionel program for at montere en passende og koordineret cellulært respons. Cellen har flere oxygen sensor enzymer, der kræver molekylært oxygen som cofaktor for deres aktivitet. Disse spænder fra prolyl-hydroxylaser til histon demethylases. De fleste undersøgelser, der analyserer cellulære reaktioner på hypoksi er baseret på cellepopulationer og gennemsnitlig undersøgelser og som sådan enkelt celle analyse af hypoxiske celler sjældent udført. Her beskriver vi en metode til analyse af den globale RNA-syntese på enkelt celle niveau i hypoxi ved hjælp af Click-iT RNA imaging kits i et ilt styret arbejdsstation, efterfulgt af mikroskopi analyse og kvantificering. Brug af cancerceller udsat for hypoxi for forskellige længder af tid, RNA mærket og måles i hver celle. Denne analyse giver mulighedvisualisering af tidsmæssige og celle-til-celle ændringer i den globale RNA-syntese efter hypoxisk stress.
Hypoxia (lav ilt spændinger) opstår, når den normale iltforsyning til et væv er forstyrret. Environmental ilt er både et næringsstof og en signalering molekyle, der giver vigtige signaler for mange celletyper. Ændringer i miljømæssig ilt sanses af en gruppe dioxygenases der styrer aktiviteten af en væsentlig transskription faktor familie kendt som Hypoxia Inducerbare Factors (HIFs). De HIFs er sammensat af to underenheder, α og β. Der er tre kendte isoformer af HIF-α (1, 2, og 3) og multiple splejsningsvarianter af HIF-1β. HIF-1β udtrykkes konstitutivt og ikke reguleret af miljømæssige ilt niveau 1. HIF-α familiemedlemmer er dynamisk reguleret af en klasse af prolyl-hydroxylaser (ph.d.) og hindrende HIF (FIH); begge kræver oxygen som en co-faktor til at katalysere hydroxyleringen af HIF-α 2,3. I normoxi HIF-α familiemedlemmer hydroxyleres og mærket til proteosomal nedbrydning af E3-ligase, von Hippel Lindau (VHL). I hypoxi de ph.d.er og FIH er inaktive eller har en reduceret aktivitet. HIF-α isoformer bliver stabiliseret, danner en heterodimer med HIF-1β og påvirke transkription af gener, der giver den cellulære reaktion på den hypoxisk miljø (figur 1A) 4..
Aktuelle teknikker til RNA-analyse fokus på kvantificering af midlede værdier på tværs af en given celle population. Celler reagerer på en hypoxisk stimulus ved at indlede transskription af et utal af gener, som tillader dem at tilpasse sig fjendtligt miljø 5.. Men hypoxi ofte eksisterer som en gradient, og celler i et hypoxisk miljø er ikke omfattet af en ensartet hypoxisk stimulus. Vi beskriver en gennemførelse af Click-iT RNA imaging kits i en ilt styret arbejdsstation til at undersøge den globale RNA-syntese på enkelt celle niveau i hypoxi.
RNA fotokonduktorsætet anvender en enlkyne-modificerede nucleosid, 5-ethynyl uridin (EU) og kemoselektiv ligering til at muliggøre påvisning af den globale RNA-syntese tidsmæssigt og rumligt i celler og væv 6. Kort fortalt behandles celler med hypoxi og dyrket i nærværelse af EU. De bliver så fast og permeabiliseres og EU-inkorporering i spirende RNA påvises ved kemoselektiv ligatur af EU med en azid indeholdende farvestof. En typisk arbejdsgang for denne reaktion er vist i figur 1B. Vi brugte RNA imaging kit til at undersøge RNA-syntese på enkelt celle niveau, der førte fra behandling med hypoxi.
Den lille størrelse af alkynen tag muliggør effektiv inkorporering af det modificerede nukleosid i RNA specifikt. Den kemoselektiv ligatur eller 'klik' reaktion er yderst effektiv, hurtig og specifik 7-10. Alle reaktionskomponenterne er bioinert og reaktionen kræver ingen ekstreme temperaturer eller opløsningsmidler. Klikket reaktion negererkravet om konventionelle radiomærkning og giver mulighed for direkte visualisering af resultaterne, da produktionen er lys. Desuden kan detektionsmolekyle let trænge komplekse prøver giver mulighed for multiplex analyse, herunder antistoffer til påvisning af RNA-interaktiv proteiner. Denne RNA imaging assay er kompatibel med organiske farvestoffer, herunder Alexa Fluor og fluorescein (FITC).
Vi målte ændringen i RNA-syntese efter behandling af vores celler ved hjælp af en implementering af den åbne mikroskopi miljø for fjerne objekter (Omero). Omero er open source-software, som findes på http://openmicroscopy.org/ . Dette mikroskop billede visualisering og analyse software giver adgang til og brug af en bred vifte af biologiske data, herunder styring af flerdimensionale, heterogene datasæt. Klienten program giver remote visualisering og analyse af komplekse biologiske billeddata 11;vi brugte det til at kvantificere de visuelle ændringer i den globale og enkelt celle RNA-syntese. Disse data og de skridt, der er nødvendige for at analysere vores RNA imaging eksperiment ved hjælp af denne mikroskop billede visualisering og analyse software er vist nedenfor.
Vi kiggede på ændringer i den globale RNA-syntese efter behandling af human osteosarcoma (U2OS) celler med hypoxi i op til 24 timer. I alle forhold, påviste vi celle-til-celle variation i niveauet af RNA-produktion. Korte tider af hypoxi eksponering ikke medfører væsentlige ændringer af niveauet for spirende RNA i cellerne. Men eksponering til 24 timer hypoxi resulterede i en betydelig stigning i mængden af RNA produceret i cellerne. De fleste af de cellulære reaktioner på hypoksi måles efter lange perioder med eksponering, såsom 4 til 24 timer. Der er dog nogle mekanismer på plads langt tidligere, for eksempel; NF-KB-aktivering forekommer inden for 5-15 min hypoxi eksponering 12. Undersøgelse kortere hypoXia eksponeringstider er derfor berettiget og kunne aflede opmærksomheden fra mere komplicerede reaktioner såsom cellecyklus og apoptose.
Vi har beskrevet vores brug af en RNA imaging kit til at undersøge effekten af hypoxi på RNA-syntese i osteosarkom (U2OS) celler. Denne teknik er forholdsvis ligetil og giver oplysninger om den globale transskription på en enkelt celle niveau. Vi modificerede konventionelle protokol til dette kit til at inkorporere mærkning på en hypoxi kammer. Til vores kendskab er dette den første rapport om anvendelsen af denne teknik til at måle ændringer i RNA-syntese i hypoxi. RNA fotokonduktorsætet vi brugte er velegnet til eksperimenter i hypoxi, da det kræver ingen radioaktive isotoper og er teknisk kompatible med de begrænsninger af at arbejde i et kontrolleret atmosfære arbejdsstation. Almindelige problemer med denne teknik bekymring effektiv fiksering og mærkning af prøven. Det er yderst vigtigt, at PFA bruges til at fastsætte prøven er frisk og vasketrinene, der følger 'klik' reaktion udføres som beskrevet for at sikre lav baggrund farvning af prøven. Hvis bAGGRUND fluorescens bliver et problem, anbefales det at vaske en gang mere med 1 ml RNA fotokonduktorsætet reaktion skyllepuffer efter trin 2.7.4.
RNA fotokonduktorsætet nævnt her udgør et betydeligt fremskridt i RNA imaging-teknologi i form af brugervenlighed og specificitet og hastigheden af reaktionen. Denne teknik er primært begrænset af den tid det tager at mærke prøven. RNA fotokonduktorsætet kræver en 1 hr mærkning periode, der forhindrer behandlingen af hurtige ændringer i den globale RNA, der normalt ville opstå inden for denne tidsramme. Det er grunden til vores første tidspunkt er begrænset til 1 time og 15 min. Teknikken er forbundet med nogle andre begrænsninger, der stort set vedrører reagens kompatibilitet med andre fluorescerende markører, for eksempel RNA'et fotokonduktorsætet er ikke kompatibel med phalloidin-farvning.
Alle eksisterende tilgange studere RNA-syntese i celler er baseret på inkorporering af modificerede nukleosider ispirende RNA og påvisning af inkorporerede etiketter ved forskellige midler. Den banebrydende metode var baseret på anvendelse af radioaktivt mærkede RNA forstadier efterfulgt af detektion med autoradiografi. Denne metode har ført til en opdagelse af cellecyklus faser og andre vigtige resultater; men det har en masse ulemper, såsom den omstændelige radioaktivitet arbejde, lange eksponeringstider og lave billeder af autoradiografi 6 opløsning. Den næste fremskridt på området udnyttes hjælp af immunkemi at eliminere nødvendigheden af radioaktivitet. RNA blev mærket ved inkorporering af Bru efterfulgt af immunokemi detektion. Men effektiv antistofbinding krævede nukleinsyre denaturering at forbedre adgangen til DNA eller RNA, der forårsagede tab af celle morfologi og skadet epitoper af mange proteiner, forhindrer deres videre detektion med fluorescens-mærkede antistoffer 13. Indførelsen af 'klik kemi "-teknologi forenklet skridt og t afsløringhan procedure i forhold til autoradiografi og immunkemi. Teknologien er baseret på azid-alkyn Huisgen cycloaddition reaktion, hvor terminal alkyn af 5-ethyniluridine binder med azid konjugeret med fluoroforen i nærvær af Cu (I). Reaktionen er specifik, hurtig, ikke kræver nogen yderligere skridt, og er let forenelig med immunkemisk påvisning af andre celle vælgere.
Ved hjælp af denne RNA-imaging-teknologi vi viste, at celler, i det samme monolag befolkning har forskellige RNA-syntese niveauer som respons på hypoxi. Vi begrænset vores eksperiment for at undersøge effekten af kun RNA produktion; det er imidlertid fuldt ud muligt med denne RNA fotokonduktorsætet at udføre modificerede, yderligere multipleksreaktioner der giver mulighed for en mere kompleks analyse af RNA-produktion. For eksempel sekundær farvning under anvendelse af et antistof specifikt for markører af aktiv transkription, såsom niveauer af phosphoryleret RNA-polymerase II eller endog dele af oversættelsetion maskiner at give en indikation af størrelsen af denne nyligt producerede RNA, som omdannes til protein er mulige. Yderligere proteiner, såsom actin, et protein, der ikke ændre sig væsentligt med hypoxi, kan afprøves som en yderligere kontrol. Endvidere kan forskellige celletyper skal testes, som det er meget sandsynligt, at forskellige celler vil have forskellige RNA syntesehastigheder og endda forskellige reaktioner på hypoxi.
Brug af dette RNA fotokonduktorsætet er ganske ligetil billede trinnene udføres som beskrevet. Kritiske trin i protokollen indebærer celleudpladning, celle fiksering og farvning og image erhvervelse. Det er vigtigt at pladen cellerne ved den beskrevne tæthed for at forhindre over eller under konfluens ved eksperimenter, som væsentligt vil påvirke resultatet. Det er også vigtigt at bruge frisk fiksativ, sikrer den bedste "øjebliksbillede" af cellen er taget, og at passe på, når du vasker cellerne efter farvning at reducere background til et niveau, der er acceptabelt for en effektiv analyse. Endelig har den metode til billedet købet er yderst vigtigt at opnå billeder, der er af en god nok kvalitet til efterfølgende analyse. Vi anbefaler at bruge det bedste lys mikroskop til rådighed til at undersøge prøver optisk såsom mikroskop anvendt i denne protokol, som er tilgængelige på de fleste forskningsintensive centre globalt.
The authors have nothing to disclose.
JB er en CRUK klinisk fyr, AS er et Wellcome Trust ph.d.-studerende, SR lab er finansieret af en CRUK Senior Research Fellowship (C99667/A12918). Dette arbejde blev støttet af to Wellcome Trust Strategic Awards (097945/B/11/Z og 095931/Z/11/Z).
U-2 OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true | |
PBS | Gibco | 14190094 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029 | |
FCS | Gibco | 10270106 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106 | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | DE17-603E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx | |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx | |
0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062 | |
Hypoxia Chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 | |
Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=601107&filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D | |
pFA | Sigma | 76240 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en®ion=GB | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en®ion=GB | |
10M NaOH | Sigma | 72068 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en®ion=GB | |
37% HCl | VWR | 20252.335 | https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or | |
VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483 | |
Actinomycin D | Sigma | A9415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en®ion=GB | |
Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | http://www.appliedprecision.com/ | |
softWoRx [Refered to in text as image processing software] | Applied Precision | N/A | http://www.api.com/softworx.asp | |
CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php | |
Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software] | OME | N/A | http://openmicroscopy.org/ | |
SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software] | Systat Software Inc. | N/A | http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php |