Vi beskriver en teknik för analys av globala RNA-syntes i hypoxi med hjälp av bildbehandling. Klicka-kemi märkning av RNA inte tidigare har utförts i enlighet med hypoxi och möjliggör visualisering av globala RNA förändringar på enskild cellnivå. Denna metod kompletterar de befintliga medelvärdes RNA-tekniker, vilket gör att direkt visualisering av cell-till-cell förändringar i den globala RNA-syntes.
Hypoxi eller sänkning av syretillgänglighet är involverat i många fysiologiska och patologiska processer. På molekylär nivå, celler initiera en särskild transkriptionsprogram för att montera ett lämpligt och samordnat cellulärt svar. Cellen äger flera syresensor enzymer som kräver molekylärt syre som kofaktor för sin verksamhet. Dessa sträcker sig från prolylspecifikt hydroxylaser till histon demethylases. Majoriteten av studier som analyserar cellulära svar på hypoxi är baserade på cellpopulationer och genomsnittliga studier, och som sådana enkelcellanalys av hypoxiska celler sällan utförs. Här beskriver vi en metod för analys av globala RNA-syntes på enskild cellnivå i hypoxi med Click-iT-RNA avbildnings kit i en syre kontrollerad arbetsstation, följt av mikroskopi analys och kvantifiering. Med hjälp av cancerceller som utsätts för hypoxi för olika lång tid, är RNA märkt och mätt i varje cell. Denna analys gör det möjligt förvisualisering av tidsmässiga och cell-till-cell förändringar i den globala RNA-syntes efter hypoxisk stress.
Hypoxi (låga syrespänningar) uppstår när det normala syretillförseln till en vävnad är störd. Miljö syre är både ett näringsämne och en signalmolekyl, som ger viktiga ledtrådar för många celltyper. Förändringar i miljö syre känns av av en grupp dioxygenases som styr aktiviteten av en viktig transkriptionsfaktor familj kallas Hypoxi Inducerbara Factors (HIFS). De HIFS är sammansatta av två subenheter, α och β. Det finns tre kända isoformer av HIF-α (1, 2, och 3) och flera splitsvarianter av HIF-1β. HIF-1β uttrycks konstitutivt och inte regleras av miljösyrenivåer 1. Familjemedlemmar HIF-α dynamiskt regleras av en klass av prolylspecifikt hydroxylaser (doktorer) och Faktor Hämmande HIF (FIH); båda kräver syre som en co-faktor för att katalysera hydroxylering av HIF-α 2,3. I normoxia de HIF-α familjemedlemmar hydroxylerade och taggade för proteosomal nedbrytning av E3-ligas, von Hippel Lindau (VHL). I hypoxi de doktorer och FIH är inaktiva eller har en minskad aktivitet. HIF-α isoformer stabiliserats, bildar en heterodimer med HIF-1β, och åstadkommande av transkription av gener som ger den cellulära responsen till hypoxisk miljö (Figur 1A) 4.
Aktuella tekniker för RNA-analys fokuserar på kvantifiering av medelvärden över en given cellpopulation. Celler svarar på en hypoxisk stimulans genom att initiera transkriptionen av en myriad av gener som tillåter dem att anpassa sig till sin fientlig miljö 5. Dock existerar hypoxi ofta som en gradient, och celler i en hypoxisk miljö inte är föremål för en enhetlig hypoxisk stimulans. Vi beskriver en implementering av Click-iT-RNA avbildnings kit i en syre kontrollerad arbetsstation för att granska den globala RNA-syntes på enskild cellnivå i hypoxi.
RNA fotoenheten använder en alkyne-modifierad nukleosid, 5-etynyl uridin (EU) och kemoselektiv ligering för att möjliggöra detektering av det globala RNA-syntes i tid och rum i celler och vävnader 6. I korthet behandlas cellerna med hypoxi och odlades i närvaro av EU. De är sedan fast och permeabiliserades och EU inkorporering i begynnande RNA detekteras genom kemoselektiv ligation av EU med en azid innehåller färgämne. Ett typiskt arbetsflöde för denna reaktion visas i figur 1B. Vi använde RNA fotoenheten för att undersöka RNA-syntes på enskild cellnivå som ett resultat av behandling med hypoxi.
Den lilla storleken av alkyn taggen möjliggör effektiv inkorporering av den modifierade nukleosiden till RNA specifikt. Den kemoselektiv ligation eller "klick" reaktion är mycket effektiv, snabb och specifik 7-10. Samtliga reaktionskomponenter är bioinerta och reaktionen kräver inga extrema temperaturer eller lösningsmedel. Klick reaktion negerarkravet för konventionell radiomärkning och tillåter direkt visualisering av resultaten eftersom utsignalen är ljus. Dessutom kan detektionsmolekylen lätt tränga komplexa prover möjliggör multiplex analys inklusive antikroppar för detektion av RNA-interaktiva proteiner. Denna RNA-imaging-analysen är kompatibel med organiska färgämnen inklusive Alexa Fluor och fluorescein (FITC).
Vi mätte förändringen i RNA-syntes efter behandling av våra celler med användning av en implementering av den öppna mikroskopi miljö för fjärrobjekt (Omero). Omero är öppen källkod, som finns på http://openmicroscopy.org/ . Detta mikroskop bild visualisering och analys ger tillgång till, och användning av ett brett spektrum av biologiska data, inklusive hantering av flerdimensionella, heterogena datamängder. Klientapplikationen möjliggör fjärr visualisering och analys av komplexa biologiska bilddata 11;Vi använde det för att kvantifiera de visuella förändringarna i den globala och enda cell RNA-syntes. Dessa data och de steg som krävs för att analysera vår RNA imaging experiment med hjälp av denna mikroskop bild visualisering och analys visas nedan.
Vi tittade på förändringar i den globala RNA-syntes efter behandling av mänsklig osteosarkom (U2OS) celler med hypoxi i upp till 24 timmar. Under alla förhållanden upptäckte vi cell till cell variation i nivån av RNA-produktion. Korta perioder av hypoxi exponeringen ledde inte till betydande förändringar av nivån av begynnande RNA i celler. Men exponering för 24 h av hypoxi gav en signifikant ökning av den mängd RNA som framställs i celler. De flesta av de cellulära svaren på hypoxi mäts efter långa perioder av exponering, t.ex. 4-24 timmar. Det finns dock vissa mekanismer införts mycket tidigare, till exempel; NF-KB-aktivering sker inom 5-15 min av hypoxi exponering 12. Undersöka kortare hypoXia exponeringstider är därför berättigad och kan förringa mer komplicerade reaktioner såsom cellcykeln och apoptos.
Vi har beskrivit vår användning av en RNA-avbildning kit för att undersöka effekterna av hypoxi på RNA-syntes i osteosarkom (U2OS) celler. Denna teknik är relativt enkelt och ger information om globala transkription vid en enda cell nivå. Vi ändrade det konventionella protokollet för detta kit för att införliva märkning i en hypoxi kammare. Såvitt vi vet är detta den första rapporten av användningen av denna teknik för att mäta förändringar i RNA-syntes i hypoxi. RNA fotoenheten som vi använt är lämplig för experiment i hypoxi eftersom det kräver inga radioaktiva isotoper och är tekniskt kompatibla med de begränsningar som arbetar i en kontrollerad atmosfär arbetsstation. Vanliga problem med denna teknik oro effektiv fixering och märkning av provet. Det är oerhört viktigt att PFA används för att fixera provet är fräsch och tvättstegen som följer klick reaktion utförs enligt beskrivning för att säkerställa låg bakgrundsfärgning av provet. Om bakgrund fluorescens blir ett problem rekommenderas det att tvätta en gång med 1 ml RNA fotoenheten reaktion sköljbuffert efter steg 2.7.4.
RNA fotoenheten som uppges är ett viktigt framsteg i RNA-bildteknik när det gäller användarvänlighet och specificitet och förmåga att reagera. Denna teknik är primärt begränsad av den tid det tar att märka provet. RNA fotoenheten kräver en märkning perioden 1 timme som hindrar en undersökning av snabba förändringar i den globala RNA som normalt skulle uppstå inom den tidsramen. Det är av denna anledning vår första tidpunkten är begränsad till 1 timme och 15 min. Tekniken är förknippad med några andra begränsningar som till stor del avser reagens kompatibilitet med andra fluorescerande markörer, till exempel, är inte kompatibel med phalloidin färgning detta RNA fotoenheten.
Alla befintliga metoder för att studera RNA-syntes i celler bygger på inkorporering av modifierade nukleosider ibegynnande RNA och detektion av inbyggda etiketter på olika sätt. Den banbrytande strategi byggde på att använda radioaktivt märkta RNA prekursorer följt av detektion med autoradiografi. Denna metod ledde till en upptäckt av cellcykelsteg och andra viktiga fynd; Men, den har en hel del nackdelar såsom tungrodda radioaktivitet arbete, långa exponeringstider och lågupplösta bilder av autoradiografi 6. Nästa framsteg inom området utnyttjas hjälp av immunkemi för att eliminera behovet av radioaktivitet. RNA märktes genom inkorporering av BRU följt av immundetektion. Men bindning effektiv antikropp krävs nukleinsyra denaturering för att förbättra tillgången till DNA eller RNA som orsakade förlust av cellens morfologi och skadade de epitoper av många proteiner, förhindrar deras vidare detektion med fluorescerande antikroppar 13. Införandet av "klickkemi" teknik förenklat detekteringssteget och tHan förfarande jämfört med autoradiografi-och immunkemi. Tekniken bygger på azid-alkynen Huisgen cykloadditionsreaktion där terminal alkyn av 5-ethyniluridine binder med azid konjugerat med fluoroforen i närvaro av Cu (I). Reaktionen är specifik, snabb, inte kräver några ytterligare steg, och är lätt kompatibel med immunkemisk detektion av andra cellbeståndsdelar.
Med användning av detta RNA-bildteknik vi visade att celler, på samma monoskikt befolkningen har olika RNA-syntesnivåer som svar på hypoxi. Vi begränsade våra experiment för att undersöka effekten av RNA-produktionen endast; Det är emellertid helt möjligt med denna RNA-fotoenheten att utföra modifierade, ytterligare multiplexa reaktioner som möjliggör en mer komplex analys av RNA-produktion. Exempelvis sekundär färgning med användning av en antikropp specifik för markörer av aktiv transkription såsom nivåer av fosforylerad RNA-polymeras II eller till och med komponenterna i översätttion maskiner för att ge en indikation på hur mycket av denna nyproducerade RNA som omvandlas till protein är möjliga. Andra proteiner, såsom aktin, ett protein som inte bör ändras påtagligt med hypoxi, kan testas som en ytterligare kontroll. Vidare kan olika celltyper skall testas, eftersom det är mycket troligt att olika celler kommer att ha olika RNA-synteshastigheter och till och med olika svar på hypoxi.
Användning av denna RNA-imaging kit är ganska enkelt förutsatt att stegen utförs enligt beskrivning. Kritiska steg i protokollet innebär cell plätering, cell fixering och färgning och bildtagning. Det är viktigt att plattan cellerna vid den beskrivna täthet för att förhindra över eller under sammanflödet vid experiment som avsevärt kommer att påverka resultatet. Det är också viktigt att använda färska fixativ säkerställer bästa "ögonblicksbild" av cellen tas och att ta hand om tvätt av cellerna efter färgning för att minska background till en nivå som är acceptabel för en effektiv analys. Slutligen är metoden för bildinhämtning oerhört viktigt att uppnå bilder som är av en tillräckligt god kvalitet för efterföljande analys. Vi rekommenderar att du använder den bästa ljusmikroskop tillgängliga undersöka prov optiskt såsom mikroskop som används i detta protokoll som finns på de flesta forskningsintensiva centra globalt.
The authors have nothing to disclose.
JB är en CRUK klinisk karl, AS är en Wellcome Trust doktorand, SR labbet finansieras av en CRUK Senior Research Fellowship (C99667/A12918). Detta arbete stöddes av två Wellcome Trust Strategiska Awards (097945/B/11/Z och 095931/Z/11/Z).
U-2 OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true | |
PBS | Gibco | 14190094 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029 | |
FCS | Gibco | 10270106 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106 | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | DE17-603E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx | |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx | |
0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062 | |
Hypoxia Chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 | |
Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=601107&filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D | |
pFA | Sigma | 76240 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en®ion=GB | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en®ion=GB | |
10M NaOH | Sigma | 72068 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en®ion=GB | |
37% HCl | VWR | 20252.335 | https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or | |
VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483 | |
Actinomycin D | Sigma | A9415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en®ion=GB | |
Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | http://www.appliedprecision.com/ | |
softWoRx [Refered to in text as image processing software] | Applied Precision | N/A | http://www.api.com/softworx.asp | |
CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php | |
Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software] | OME | N/A | http://openmicroscopy.org/ | |
SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software] | Systat Software Inc. | N/A | http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php |