Summary

Beoordeling van de Vasculaire Regeneratie in het CZS met de muis Retina

Published: June 23, 2014
doi:

Summary

Het knaagdier netvlies is lang erkend als een toegankelijke venster naar de hersenen. In dit technisch document bieden we een protocol dat het muismodel van zuurstof geïnduceerde retinopathie van de mechanismen die leiden tot het falen van vasculaire regeneratie binnen het centrale zenuwstelsel na ischemische schade te bestuderen in dienst heeft. Het beschreven systeem kan ook worden ingezet om strategieën te ontwikkelen om hergroei van functionele bloedvaten te bevorderen binnen het netvlies en CNS.

Abstract

Het knaagdier netvlies is misschien wel de meest toegankelijke van zoogdieren systeem waarin om neurovasculaire samenspel binnen het centrale zenuwstelsel (CNS) te onderzoeken. Het wordt steeds meer erkend dat verscheidene neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, multiple sclerose en amyotrofe laterale sclerose aanwezige elementen van vasculaire compromis. Bovendien zijn de belangrijkste oorzaken van blindheid bij kinderen en werkende leeftijd populaties (prematuren retinopathie en diabetische retinopathie, respectievelijk) gekenmerkt door vasculaire degeneratie en falen van fysiologische vasculaire hergroei. Het doel van dit technische document is een gedetailleerd protocol bieden aan CNS vasculaire regeneratie te bestuderen in het netvlies. De werkwijze kan worden toegepast om de moleculaire mechanismen die leiden tot falen van vasculaire groei na ischemisch letsel te helderen. Daarnaast kunnen potentiële therapeutische modaliteiten te versnellen en het herstel van gezonde vasculaire plexus worden onderzocht. Bevindingen obtaineD De beschreven benadering kan therapeutische middelen voor ischemische retinopathie zoals diabetes of prematuriteit en eventueel gebruikmaken andere vasculaire aandoeningen van het CZS.

Introduction

Gedurende CNS ontwikkeling, zenuwen, immuuncellen en bloedvaten vast opmerkelijk gekoppeld netwerken om adequate weefsel perfusie zorgen en laat de transmissie van sensorische informatie 1-5. De verdeling van vasculaire systemen resulteert in onvoldoende zuurstofvoorziening van de weefsels en gecompromitteerde metabole vraag en wordt steeds meer erkend als een belangrijke bijdrage aan de pathogenese van neurodegeneratieve ziekten 6. Vasculaire uitval en de verslechtering van de neurovasculaire eenheid binnen de hersenen, bijvoorbeeld, is geassocieerd met vasculaire dementie, vasculaire laesies van de witte stof van de hersenen 7 en Alzheimer met stenose van arteriolen en kleine vaten 8. Bovendien wordt verslechterde vasculaire barrièrefunctie gedacht multiple sclerose 9 en amyotrofe laterale sclerose 10 dragen.

Van direct belang zijn voor de retinale model beschreven in dit protocol, verblindendeziekten zoals diabetische retinopathie en 11 retinopathie van prematuriteit 12, 13 gekenmerkt door een fase van vroege vasculaire degeneratie. De daaropvolgende ischemische belasting van de neurovasculaire netvlies veroorzaakt een tweede fase van overmatig en pathologische neovascularisatie die waarschijnlijk afkomstig als compenserende reactie opnieuw instate zuurstof en energievoorziening 14-16. Een aantrekkelijke strategie om de ischemische stress die centraal ziekteprogressie overwinnen is om functionele vasculaire netwerken herstellen specifiek in de ischemische gebieden van de neuro-retina (figuren 2 en 3). Veroorzakend een gecontroleerde angiogene respons kan overkomen contra-intuïtief een aandoening waarbij anti-angiogene behandelingen zoals anti-VEGF's worden beschouwd als aangepast behandelingen. Toch bewijs voor de geldigheid van deze aanpak is montage. Bijvoorbeeld, het verbeteren van "fysiologische-achtige" vasculaire hergroei in ischemic retinopathiën is elegant aangetoond door middel van introductie van endotheliale voorlopercellen 17, remming van Müller-cel tot expressie VEGF geïnduceerde downregulatie van andere angiogene factoren 18, injectie van myeloïde voorlopercellen 19, remming van NADPH oxidase geïnduceerde apoptose 20, het verhogen van de voeding ω-3 meervoudig onverzadigde vetzuren zuur inname 21 behandeling met een carboxyl-terminaal fragment van tryptofaan tRNA synthetase 22 en directe toediening van VEGF of FGF-2 voor de bescherming van gliacellen 23. Bovendien hebben we aangetoond dat het moduleren van neuronale klassieke Praktische signalen zoals Semaforines of netrins in ischemische retinopathie versnelt vasculaire regeneratie van gezonde vaten in het netvlies en daardoor vermindert pathologische angiogenèse 24, 25. Van directe klinische relevantie, een aantal van de hiervoor genoemde dierlijke studies tonen aan dat het bevorderen van vasculaire regeneratie tijdens de vroege fase van ischemische retinopathie kan een aanzienlijke besparing-zicht bedreigen pre-retinale neovascularisatie 19, 23, 24, 26, waarschijnlijk door de vermindering van ischemische belasting.

Het bedenken van therapeutische strategieën die regeneratie van functionele schepen te stimuleren blijft een belangrijke uitdaging voor vasculaire biologen. Hier beschrijven we een experimenteel systeem dat de muis-model van zuurstof-geïnduceerde retinopathie (OIR) om strategieën te verkennen om vasculaire hergroei te moduleren in het netvlies in dienst heeft. Ontwikkeld door Smith et al.. In 1994 27, dit model fungeert als een proxy voor de menselijke proliferatieve retinopathieën en bestaat uit het blootstellen van P7 muis pups tot 75% O 2 tot P12 en vervolgens opnieuw introduceren van de pups tot omgevingstemperatuur O 2-spanning (Figuur 1). Dit paradigma losjes bootst een scenario waarbij een te vroeg geboren baby wordt geventileerdmet O 2. De blootstelling van de muis pups te hyperoxie veroorzaakt degeneratie van het netvlies haarvaten en microvasculature, en levert een reproduceerbare gebied van vaso-uitwissen (VO) doorgaans aan bij het ​​verlaten van O 2 op P12, hoewel maximale VO gebied na wordt bereikt bij 48 uur (P9) blootstelling aan O2 28. In de muis, de avasculaire VO zones spontaan te regenereren in de loop van de week na herintroductie om ruimte lucht en uiteindelijk VO zones zijn volledig opnieuw gevasculariseerd (figuur 2). Herintroductie kamerlucht van muizen blootgesteld aan OIR lokt pre-retinale neovascularisatie (NV) (maximaal bij P17) die meestal wordt beoordeeld om de effectiviteit van anti-angiogene behandeling paradigma bepalen. In zijn zuiverste vorm, de OIR model geeft een zeer reproduceerbare en kwantificeerbare instrument om zuurstof-geïnduceerde vasculaire degeneratie beoordelen en bepalen de omvang van de destructieve pre-retinale neovascularisatie 29-31.

<p class = "jove_content"> Diverse exploratieve behandeling paradigma dat CNS vasculaire regeneratie moduleren kan worden onderzocht met behulp van de OIR model inclusief het gebruik van farmacologische stoffen, gentherapie, gendeletie en meer. De neiging van een bepaalde aanpak van vasculaire hergroei te beïnvloeden wordt beoordeeld stapsgewijs in het venster tussen P12 (maximale VO na verlaten hyperoxia) en P17 (maximale NV). Evaluatie van de resultaten van de behandeling op pathologische NV kan snel en eenvoudig worden bepaald parallel en is grondig beschreven door Stahl en collega's 30, 31. Hier geven we een eenvoudige stap-voor-stap procedure om de modulatie van fysiologische revascularisatie onderzoeken in de neurale retina van farmacologische verbindingen potentiële therapeutica, virale vectoren of de invloed van kandidaat genen in transgene of knockout-muizen te bestuderen.

Protocol

Ethiek verklaring: Alle dierproeven houdt zich het dier zorg richtlijnen die door de Vereniging voor Onderzoek naar Visie en Oogheelkunde (ARVO) verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research en de Canadese Raad van Animal Care. 1. Zuurstof Induced retinopathie (OIR) Geboortedatum van muisjongen als P0 Record. Noteer alle gewichten van de dieren bij binnenkomst in O 2 om een voldoende gewicht bereik te garanderen. …

Representative Results

De OIR model wordt veel gebruikt om zuurstof geïnduceerde vasculaire degeneratie en ischemie geïnduceerde pathologische neovascularisatie studeren in de retina en is bij de ontwikkeling van de momenteel toegepaste anti-angiogene behandelingen voor oogziekten 27, 29, 30 zijn. Bevindingen verkregen met behulp van dit model kan los worden geëxtrapoleerd naar ischemische retinopathie zoals proliferatieve diabetische retinopathie en retinopathie van prematuriteit 30. Hier…

Discussion

Wat is de meest effectieve manier om de groei van nieuwe gezonde schepen in ischemisch zenuwweefsel stimuleren? Is het therapeutisch geldig te beïnvloeden en versnellen van nature voorkomende vasculaire hergroei? In de neuro-ischemische aandoeningen zoals ischemische retinopathie of een beroerte, wordt vasculaire degeneratie geassocieerd met een verminderde neuronale functie 35-38. Vandaar vroeg letsel tegen te gaan, het herstel van regionale micro-circulatie tijdens de onmiddellijke / vroege segment van de …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PS heeft een Canada Research Chair in retinale Celbiologie en de Alcon Research Institute New Investigator Award. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Canadese Institutes of Health Research (221.478), de Canadese Diabetes Association (OG-3-11-3329-PS), de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (418.637) en de Stichting Bestrijding Blindheid Canada. Ondersteuning werd ook door de Reseau de Recherche en Sante de la Vision du Quebec.

Materials

C57Bl/6 mice ((Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers Vendor of choice
Operating Scissors straight World Precision Instruments 14192
Dissecting Scissors straight World Precision Instruments 14393
Vannas Eye Scissors Harvard Apparatus 72-8483
Iris Forceps, curved, serrated World Precision Instruments 15915
Brushes 362R size 0 Dynasty
Dumont Forceps #3; straight World Precision Instruments 500338
Surgical Blade, size 10 Bard-Parker 371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories, Inc RL-1102
Microscope slides VWR 16004-368
Fluoromount G Electron Microscopy Sciences 17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 Sigma-Aldrich 46945

References

  1. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
  2. Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular Parallels between Neural and Vascular Development. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).
  3. Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. Guidance of vascular development: lessons from the nervous system. Circ Res. 104, 428-441 (2009).
  4. Stefater Iii, J. A., et al. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells. Nature. 474, 511-515 (2011).
  5. Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. Potential role of microglia in retinal blood vessel formation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).
  6. Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications. Neuron. 71, 406-424 (2011).
  7. Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).
  8. Brun, A., Englund, E. A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study. Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).
  9. Prat, A., et al. Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).
  10. Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS. Neurology. 74, 821-827 (2010).
  11. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).
  12. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and management of retinopathy of prematurity. N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).
  13. Sapieha, P., et al. Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life. J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).
  14. Chen, J., Smith, L. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).
  15. Cheung, N. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).
  16. Smith, L. E. Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).
  17. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56, 960-967 (2007).
  18. Wang, H., et al. VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression. Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).
  19. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).
  20. Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Vis. 13, 840-853 (2007).
  21. Connor, K. M., et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. 13, 868-873 (2007).
  22. Banin, E., et al. T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).
  23. Dorrell, M. I., et al. Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy. Glia. 58, 43-54 (2010).
  24. Joyal, J. -. S., et al. Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A. Blood. 117, 6024-6035 (2011).
  25. Binet, F., et al. Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1. Cell Metab. 17, 353-371 (2013).
  26. Fukushima, Y., et al. Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice. J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).
  27. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).
  28. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).
  29. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  30. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).
  31. Stahl, A., et al. Computer-aided quantification of retinal neovascularization. Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).
  32. Stahl, A., et al. Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy. Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).
  33. Cerani, A., et al. Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1. Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).
  34. Sapieha, P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis. Blood. 120, 2182-2194 (2012).
  35. Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).
  36. Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina. Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).
  37. Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke. Stroke. 38, 827-831 (2007).
  38. Li, L., et al. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke. Brain Res. 1132, 185-192 (2007).
  39. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).
  40. Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).
  41. Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice. Nat Genet. 16, 93-95 (1997).
  42. Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).

Play Video

Citer Cet Article
Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).

View Video