Summary

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em> Ex Vivo</em> Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Published: April 03, 2014
doi:

Summary

Neuronale Membrantransport steuert dynamisch die Plasmamembran Protein Verfügbarkeit und wirkt sich deutlich auf die Neurotransmission. Bis heute hat es sich herausfordern, um neuronale endozytischen Handel bei erwachsenen Nervenzellen messen. Hier beschreiben wir eine hochwirksame, quantitative Methode, um schnelle Veränderungen in der Oberflächenproteinexpression ex vivo in akuten Hirnschnitten messen.

Abstract

Geregelte endozytischen Handel ist der zentrale Mechanismus erleichtert eine Vielzahl von neuromodulatorischen Veranstaltungen, die von dynamischen Steuerung Rezeptor-Ionenkanal und Transporter Zelloberfläche Präsentation auf einem Minuten-Zeitskala. Es gibt eine breite Vielfalt von Mechanismen, die endozytischen Handel einzelner Proteine ​​steuern. Studien zur Untersuchung der molekularen Grundlagen von Menschenhandel wurden in erster Linie auf die Oberfläche Biotinylierung verlassen, um quantitativ Veränderungen in der Membranproteinoberfläche messen Ausdruck als Reaktion auf exogene Reize und Gen-Manipulation. Allerdings wurde dieser Ansatz vor allem auf kultivierten Zellen, die nicht treu die physiologisch relevanten Mechanismen im Spiel bei erwachsenen Neuronen spiegeln kann begrenzt. Darüber hinaus kann kultivierten Zell Ansätze regionsspezifische Unterschiede in Handel Mechanismen unterschätzen. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der Zelloberfläche Biotinylierung der akuten Hirnschnittpräparat erstreckt. Wirzeigen, dass diese Methode bietet eine High-Fidelity-Ansatz zur schnellen Veränderungen in der Membranproteinoberfläche Ebenen bei erwachsenen Nervenzellen messen. Dieser Ansatz dürfte eine breite Dienstprogramm auf dem Gebiet der neuronalen endozytischen Handel zu haben.

Introduction

Endozytischen Handel ist ein allgegenwärtiges zellulären Mechanismus, der die Feinabstimmung des Plasmamembran Präsentation einer Vielzahl von integralen Membranproteinen. Endozytose liefert lebenswichtige Nährstoffe, um die intrazelluläre Milieu 1 und desensibilisiert-Rezeptor-Signal als Reaktion auf 2-Rezeptor-Aktivierung. Endocytotischen Recycling zurück in die Plasmamembran erhöhen zusätzlich zelluläre Signalgebung durch Erhöhung der Proteinexpressionsniveaus an der Zelloberfläche 3. Darüber hinaus sind Membrantransport Störungen in zahlreichen Krankheiten und pathologischen Bedingungen 4,5 verwickelt, und betonte die Notwendigkeit, die molekularen Mechanismen, die Protein endozytischen Handel regieren zu untersuchen. Während viele Proteine ​​nutzen klassische Clathrin-abhängigen Internalisierung Mechanismen, Anzeichen dafür in den vergangenen Jahren zeigt, dass mehrere Clathrin-unabhängige Mechanismen endozytischen regeln die endozytischen Potential einer wachsenden Palette vonProteine ​​6,7. So hat die Notwendigkeit, endozytischen Mechanismen für Menschenhandel in physiologisch relevanten Systemen zu untersuchen stark gewachsen.

Im Gehirn hat endozytischen Handel von Rezeptoren, Ionenkanäle und Neurotransmitter-Transporter eine primäre Rolle bei der Gründung der synaptischen Plastizität 8-11 und der Reaktion auf Drogen 12-15, letztlich Auswirkungen auf die neuronale Erregbarkeit und synaptischen Antworten. Bis heute hat die Mehrheit der neuronalen Handel Studien entweder heterologen Expressionssystemen oder kultivierten primären Nervenzellen verlassen können, von denen weder zuverlässig reflektieren Mechanismen eine Rolle spielen bei erwachsenen Neuronen. Hier ein Ansatz, der Biotinylierung Oberfläche verwendet, um quantitativ Oberflächenproteinspiegel in akuten Hirnschnitten von erwachsenen Nagern abgeleitet messen berichten wir. Mit diesem Ansatz können Daten, die zeigen, dass die Maus striatale Dopamin-Transporter schnell verinnerlicht in re präsentieren wirReaktion auf Phorbolester-vermittelte Protein-Kinase C (PKC).

Protocol

Alle Tierbehandlung und Gewebe Ernte wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care Use Committee (IACUC) durchgeführt, nach dem genehmigten Protokoll # A1506 (Melikian, PI). Benötigte Lösungen Künstliche Liquor (ACSF) – Machen Sie täglich frisch 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl <s…

Representative Results

Die neuronale Dopamintransporter wird in Reaktion auf PKC-Aktivierung in Zelllinien 16-20 internalisiert. Obwohl viele Berichte zeigen PKC-induzierte DAT Oberflächenverluste in einer Vielzahl von Zelllinien und Expressionssystemen ist es schwierig gewesen, diese Feststellung in kultivierten dopaminergen Neuronen 21-23 bestätigen. Wir verwendeten Maus Striatum Scheiben direkt zu testen, ob DAT verinnerlicht als Reaktion auf PKC-Aktivierung in der Erwachsenen dopaminergen Neuronen. Folgende Schnitt…

Discussion

Trotz langjährige Wissen, dass endozytischen Handel kritisch Auswirkungen synaptischen Signal im Gehirn, hat es schwierig, quantitativ Veränderungen in der Proteinoberflächen-Expression in adulten Neuronen messen bewährt. In dieser Arbeit, einen zuverlässigen Ansatz zur Oberflächenprotein ex vivo in akuten Hirnschnitten beschriften berichten wir. Hirnschnittpräparate haben eine langjährige Geschichte der Nutzen für elektrophysiologischen Ableitungen, wie sie synaptischen Verbindungen und die Lebensfäh…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse DA15169 und DA035224 zu HEM finanziert

Materials

sulfo NHS-SS-biotin Pierce 21331
Streptavidin agarose Pierce 20347
IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin Sigma A3059
Vibrating microtome sectioner Various
Shaking water bath various
Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) Millipore PI8P 012 50 These can be washed by hand and re-used

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Citer Cet Article
Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons. J. Vis. Exp. (86), e51240, doi:10.3791/51240 (2014).

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