Открытие новых внутриклеточных патогенов на Amoebal сокультивирования и подходов Amoebal обогащению
Summary
Amoebal сокультивирования это система культуры клеток с помощью клейкого амеб выборочно растут внутриклеточных возбудителей способны противостоять фагоцитарные клетки, такие как амебы и макрофагов. Таким образом, он представляет собой ключевой инструмент для себя новые инфекционные агенты. Amoebal обогащение позволяет открытие новых amoebal видов и их специфических внутриклеточных бактерий.
Abstract
Внутриклеточных патогенов, таких как легионеллы, микобактерий и Chlamydia-подобных организмов трудно выделить, потому что они часто растут плохо или вообще не на селективной среде, которые обычно используются для выращивания бактерий. По этой причине, многие из этих патогенов были обнаружены только недавно или после важных вспышек. Эти патогены часто связаны с амеб, которые служат клетке-хозяине и позволить выживание и рост бактерий. Мы намерены здесь, чтобы предоставить демонстрацию двух методов, которые позволяют выделение и характеристика внутриклеточных патогенов присутствует в клинических или проб окружающей среды: amoebal сокультивирования и amoebal обогащению. Amoebal сокультивирования позволяет восстановление внутриклеточных бактерий путем посева исследуемого образца на качестве amoebal газон, который может быть заражен и лизируют внутриклеточных бактерий, присутствующих в образце. Amoebal обогащение позволяет восстановление амеб присутствует в клинических или окружающей образца. Чтбудет может привести к открытию новых amoebal видов, но и новых внутриклеточных бактерий, растущих в частности, в этих амеб. Вместе эти два методы помогают открыть для себя новые внутриклеточные бактерии, способные расти в амеб. Из-за их способности инфицировать амебы и противостоять фагоцитоз, эти внутриклеточных бактерий также может избежать фагоцитоз макрофагов и, таким образом, быть патогенными для высших эукариот.
Introduction
До появления молекулярной диагностики, микроорганизмы, присутствующие в окружающей среде нишах или в клинических образцах часто обнаруживается путем культивирования их на разных селективных средах, в основном на агар в чашках Петри. Фенотип бактериальных колоний и их метаболической активности бактерий затем дают классификацию на видовом уровне. Бульон также могут быть использованы для повышения чувствительности детектирования. Тем не менее, оба метода не позволяют восстановление бактерий, которые растут медленно или вообще не на этих средах. Это причина, почему молекулярные подходы так широко используется в настоящее время. Тем не менее, обнаружение ДНК не дает никакой подсказки на жизнеспособность бактерий. Кроме того, Вопреки культуры, молекулярные подходы не приведет к деформации, которые могут быть дополнительно охарактеризованы.
Изучение патогенных микроорганизмов, которые растут плохо на твердой среде или которые нуждаются клеток расти сложно. Большинство из них "трудно расти" бактерии привередливый ВВЕДЕНИбесклеточные бактерии, часто открытые и характеризуются следующие крупных вспышек, как это было в случае с легионелл. Эта бактерия характеризуется после вспышки, которая произошла во время конвенции Американского легиона. Целых 182 человек были инфицированы и 29 умер из-за тяжелой пневмонии 1,2. Позже было показано, что амебы были естественными носителями этой бактерии и что их присутствие в отель системы кондиционирования воздуха и водопроводных сетей было в начале вспышки заболевания так называемой легионера 3.
Амеба присутствуют во всем мире и были изолированы от почвы, воздуха, воды и слизистой оболочки носа человеческих добровольцев (отзывы в 4). Эти "свободной гостиная" амебы обычно деления автономно в окружающую среду, но может иногда вторгаются разрешительных хозяев 5. Амеба питаются различными микроорганизмами через фагоцитоза и последующего лизосом переваривания гиdrolases 6. Многие факультативные или облигатными внутриклеточными бактериями способны противостоять пищеварение и таким образом заразить и разделить в амеб как, например Legionella, Chlamydia, связанные с бактериями или микобактериями (отзывы в 7 и 8). Бесплатный амебах всего представляют собой важный потенциальный резервуар для внутриклеточных бактерий, которые еще не были обнаружены. Это привело нашу группу для реализации в Лозанне две основные методы, называемые amoebal сокультивирования и amoebal обогащения, что позволило разные группы, чтобы изолировать несколько новых облигатными внутриклеточными микроорганизмами из различных проб окружающей среды 9-15.
С амебы профессиональные фагоциты, пасущиеся на бактерии, бактерия способна противостоять фагоцитоз и расти внутри этих простейших также может колонизировать человека фагоциты и быть патогенными по отношению к людям. Это было частично показано для некоторых Хламидиоз-родственных бактерий, таких как Waddlia чоndrophila. W. chondrophila может расти не только в амебы, но и в нескольких типов клеток, таких как эпителиальные клетки млекопитающих, макрофагов и клеточных линий 16-18 рыб. Amoebal сокультивирования также появляется соответствующая для обнаружения внутриклеточных бактерий в клинических образцах 19,20, включая табуретки, которые сильно загрязненных различных видов бактерий 21.
Здесь мы опишем основные этапы amoebal сокультивирования и amoebal обогащения, в том числе (а) лечения экологических или клинических образцах, (б) ростом амеб на аксенными СМИ и на бактериальной лужайке кишечной палочки и (с) отбора и характеристики внутриклеточных бактерий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Amoebal сокультивирования и amoebal обогащения являются эффективные методы, которые позволили изоляцию многих новых бактериальных и amoebal видов. Результаты, полученные с помощью этих методов подтверждения вездесущий присутствие как амебы и амебы-стойкой бактерий в окружающей среде, и что са?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Pr. Бернар Ла Скола за полезные технических советов и интересной дискуссии на amoebal сокультивирования и amoebal обогащения. Мы также благодарим доктора Винсента Томаса за его помощь в реализации технику в нашей лаборатории.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 108342 | |
| 0.22 μm pore size membrane | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCVPU11RE | |
| proteose peptone | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 211693 | |
| yeast extract | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 212750 | |
| Cell culture flasks | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 353135 | |
| Kova slide | Hycor, Indianapolis, IN | 87144 | |
| cell culture microplates | Corning Inc, Corning, NY | 3524 | |
| Diff-Quik staining kit | Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany | 130832 | |
| Ziehl fuchsin | Fluka, St-Louis, MI | 21820 | |
| basic fuchsin | Sigma, St-Louis, MI | 857843 | |
| Phenol | Sigma, St-Louis, MI | P1037 | Corrosive and mutagenic |
| malachite green oxalate | Fluka, St-Louis, MI | 63160 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15710 | |
| Saponin | Sigma, St-Louis, MI | 84510 |
References
- Fraser, D. W., et al. Legionnaires’ disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
- McDade, J. E., et al. Legionnaires’ disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
- Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
- Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
- Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
- Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
- Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
- Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
- Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
- Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis’ gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
- Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
- Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
- Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
- Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
- Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
- Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
- Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
- Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
- Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
- Isenberg, H. D. . Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
- Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
- Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
- Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
- Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
- Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
- Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
- La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
- Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
- La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
- Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
- Lienard, J., Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
- La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
- Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
- Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
- Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
- Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
- Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
- Lienard, J. G., Ashbolt, K., Sen, N. J. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. , 143-162 (2011).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
- Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).
