设计师核酸酶如锌指核酸酶(ZFN)和转录活化因子样效应核酸酶(TALENS)可用于通过触发两个非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)途径来修改小鼠早期胚胎的基因组。这些进展使快速生成小鼠的精确的遗传修饰。
携带位点特异性基因组的修饰(敲除,敲入)转基因小鼠中是极为重要的解剖复杂的生物系统,以及用于模拟人类疾病和测试的治疗策略。在使用设计者核酸酶如锌指核酸酶(ZFN),转录激活因子样效应核酸酶(TALENS),以及集群定期interspaced短回文重复序列(CRISPR)/ CRISPR相关(CAS)系统9对站点的最新进展特定基因工程打开,而不需要依赖于胚胎干(ES)细胞技术在几乎所有的实验室物种进行快速靶向的基因组修饰的可能性。一个基因组编辑实验,通常开始鉴定目的基因其次是建筑定制的DNA结合结构域的直接核酸酶活性的研究者定义的基因组位点内的设计师核酸酶靶位点。设计师核酸质粒在体外</ em>的转录生成的mRNA为受精小鼠卵母细胞显微注射。在这里,我们提供了一个协议,用于通过直接注射TALEN mRNA的实现有针对性的基因组改造成受精小鼠卵母细胞。
小鼠是目前产生转基因动物模型最流行的平台。多功能工具箱的小鼠胚胎1-3的基因工程已经由基于核酸的设计师如锌指核酸酶(ZFN)的基因组编辑方法最近延长4-6,转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)7,8,和群集定期interspaced短回文重复序列(CRISPR)/ CRISPR相关性(CAS)9系统9。 ZFN和TALEN函数作为对两个定制设计的基于蛋白质的DNA结合结构域(锌指蛋白的阵列和重复变量二-残基(倒车视像),分别)分别耦合到所述的FokⅠ核酸内切酶是10-12的。相反,Cas9介导的DNA切割的特异性是通过反式激活CRISPR的RNA(crRNA和tracrRNA,它也可以合并成一个单一的嵌合RNA分子称为导RNA)提供11,其作用在同一个复CRISPR蛋白质。
塔伦斯与定义的倒车视像装置的顺序可以迅速构建了与众多的装配策略,从13-17到选择个别实验者。 CRISPR/Cas9承诺甚至更少的劳动密集型代设计师核酸酶,但导的RNA-DNA的特异性结合仍然没有彻底解决18,19。定制的ZFN的产生迄今被限制在专门的学术实验室和商业供应商如Sangamo生物科学和适马的CompoZr服务。
一般情况下,基因组与设计师核酸编辑的目的是在定义的基因位点,随后吸引非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)DNA修复机器10,12引入双链断裂(DSB)。一个DSB的NHEJ介导的维修往往会导致在接近维修部位引入的插入和删除的。因此NHEJ修复ç一个被利用为敲除靶基因通过导入基因的蛋白质编码序列4,7,9中的移码突变的功能。或者,定义添加或更换遗传信息可以通过提供一种DNA供体连同设计者核酸酶来实现。 DNA供体包括由具有同源性靶基因座的两侧区域调查设计的DNA序列,从而作为对DSB修复模板,通过人力资源。两种质粒5,6,20和单链寡核苷酸8,9,21已被成功地用作供体。既不NHEJ-去HR介导的基因组编辑需要引入的选择标记的插入小鼠胚胎,这使得这些策略特别适合于不妨碍总体遗传结构中的核苷酸序列产生小的改变的基因组中。
在这个协议中,我们描述了基因组编辑所有必要程序小鼠胚胎塔兰使用。这些包括:1)识别一个TALEN目标站点22,2)施工TALENS由金门克隆13,3) 在体外合成TALEN mRNA表达,4)微注射TALEN mRNA向受精小鼠卵母细胞中,5)外科手术中用于胚胎移植的和6)在创办人动物TALEN诱导的诱变分析。我们专注于TALEN基因显微注射和奠基人的NHEJ引起的插入/缺失的筛查。为此目的,我们已经生成双官能TALEN结构,允许在哺乳动物细胞中都表达时,如质粒和体外合成TALEN mRNA的显微注射入小鼠胚胎转染。这些结构包括截断TALE骨干23融合到异源二聚体的FokⅠ为最佳的基因组编辑在哺乳动物细胞中域24,25。这个协议也可以用于其他设计师核酸注射或设计师核酸酶结合采用注射和捐助结构(DNA捐赠者的设计已经在良好的技术出版物被描述的Wefers 等 26,27)。
道德声明
所有动物实验均按照苏黎世州的州级兽医办公室的指导方针和规定执行。
设计师核酸酶驱动的基因组编辑方法已显著延长物种适合于它们各自的基因组10,12的靶向修饰的范围内。在小鼠中,基因靶向ES细胞一直是一个标准的技术超过二十年;然而,它已被证明难以适应从品种较其它鼠标胚胎干细胞,虽然出现了一些最近成功在大鼠胚胎干细胞。即使有“现成的,现成的”基因靶向小鼠ES细胞由财团如EUCOMM,KOMP,或NorCOMM 3的基因组编辑由ZFN和TALEN提供更高的精度和有关的修改,可以将频谱灵活性提供克隆的可用性引入到小鼠基因组中。携带核酸酶介导的基因突变动物的创始人似乎是高度的种系主管4-6,20,21,这并不总是对嵌合体从囊胚注射ES细胞的起源的情况。因此,在DES的某些情况下显微注射igner核酸酶可导致显著更快的一代新型鼠标线有针对性的基因组修改。
成功代基因敲除小鼠注射ZFN和TALEN取决于对注入对核酸酶的活性有很大影响。 TALENS已被证明具有高的成功率在目标范围广泛的基因在许多生物体中;然而,最近的研究表明,TALEN结合是胞嘧啶甲基30,31敏感,因此,新产生的核酸对,例如TALENS克隆到pCAG-T7载体,可瞬时转染到鼠细胞系,例如NIH-3T3或神经-2a中,它模仿了小鼠胚胎的染色质状态到一定程度。在这里,核酸酶活性可以用T7核酸内切酶分析或PCR产物的限制性酶切如前mRNA的合成和显微注射在第5节所述来估计。我们建议在尊重兴趣的基因组区域的测序的ive细胞系和用于显微注射实验的小鼠品系。
在小鼠受精卵,不同TALEN或ZFN对将最佳状态工作在不同的mRNA浓度,因此,显微注射核酸酶mRNA的最佳工作浓度可能必须通过实验确定。根据不同的核酸酶对,浓度太低会导致无解理,而过高会导致胚胎致死。取决于核酸对,我们已使用的总mRNA浓度低至2纳克/微升和高达200微克/微升过成功。这些影响是难以从在细胞培养物和核酸浓度最佳为胚胎存活和目标轨迹的变形速率需要根据经验确定的实验来预测。
高活性的ZFN或TALEN可切割其靶序列以外的显微注射胚胎的单细胞阶段,从而导致复杂的诱变的图案ð镶嵌在创始人。我们和其他4已经在一个单一的创始人( 图5C)观察到三个或更多个不同的突变等位基因。因此,建立从这些创办新的鼠标线时,后代应仔细测序的有利突变的存在,因为消化测定提供证据仅一个未定义的突变的存在筛选。
之一的批评经常对ZFN和TALEN系统表示这样的可能性,即这些核酸酶也能够裂解在类似于目标位点的基因组中存在别处序列。这样的脱靶效应已被观察到与初代试剂使用的同型二聚体的FokⅠ域和异源二聚体构建体被设计为减轻脱靶效应25。潜在的脱靶部位可以预测到一定程度,在硅片 32,33和通过PCR和测序进行筛选。一个明显的优势ØF使用的ZFN和TALENS用于产生小鼠而不是细胞系是除去脱靶突变通过执行几个回交至所选择的野生型菌株未链接到所需的基因组修饰的可能性。供了大量的建小鼠,从核酸靶向基因座产生和在计算机芯片预测的脱靶PCR产物的下一代深度测序分析基因座可能提供一个替代的定性和定量的读出到PCR产物的消化测定。
在此协议中描述的辅助生殖技术用于显微注射实验,如C57BL/6J或B6D2F1标准的小鼠品系进行了优化。产地不同,如远交品系小鼠,原则上可以用于基因组的编辑方法和可能提供更合适的遗传背景,具体的研究问题。如超数排卵辅助生殖技术的性能可以prediCTED为一些菌株34-36的,但可能需要为了进一步优化非标准菌株获得的胚胎的足够数量的核酸显微注射。
此外ZFN和TALEN,新设计师核酸酶如RNA引导的CRISPR/Cas9系统9,37,38现在已经被引入的基因组编辑应用程序。所有方法用于显微注射和此处描述的创始人动物的分析也适用于CRISPR/Cas9和基因组编辑的将来模式。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢莫妮卡Tarnowska的,科妮莉亚阿尔布雷希特和埃娃Skoczylas优秀的技术援助。这项研究是由SNF Sinergia授予CRSI33-125073于PP。
BsaI | NEB | R0535S or L |
Esp3I | Thermo Scientific | ER0451 |
T4 Ligase | NEB | M0202S or L |
Spectinomycin | Sigma | S0692-1ML |
Ampicillin | Sigma | A0166 |
X-Gal | Sigma | B4252 |
IPTG | Sigma | I6758 |
Plasmid-Safe nuclease | Epicentre | E3101K |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 |
QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 |
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit | Invitrogen | AM1345 |
NucAway Spin Columns | Invitrogen | AM10070 |
RNaseZAP | Sigma | R2020-250ML |
NorthernMax Formaldyde Load Dye | Invitrogen | AM8552 |
RNA Millennium Markers | Invitrogen | AM7150 |
10x TBE buffer | Thermo Scientific | B52 |
T7 endonuclease | NEB | M0302S or L |
pGEM-T EasyVector System I | Promega | A3600 |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S-7563 |
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG) | Sigma | G4877 |
human chorionic gonadotropin (hCG) | Sigma | CG5 |
M2 embryo culture medium | Sigma | M7167 |
M16 embryo culture medium | Sigma | M7292 |
Mineral oil, embryo tested | Sigma | M8410 |
Ketamine | CentraVet | Ket 201 |
Xylazine | Sigma Aldrich | 46995 |
Equipment/Tools | ||
Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200) | Nikon | |
Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF) | Narishige | |
Embryo holding capillaries | Sutter instruments | B100-75-10 |
Embryo injection capillaries | Narishige | GD-1 |
Capillary puller (for example Sutter P97) | Sutter instruments | |
Microforge (for example Narishige MF-900) | Narishige | |
Walton skin scissors | FST | 14077-10 |
Surgical scissors | FST | 14041-10 |
Surgical probe | FST | 10140-03 |
Reflex wound clip system (9mm) | FST | 12031-09 |
Reflex wound clips (9mm) | FST | 12032-09 |
Dumont fine forceps 5 | FST | 11254-20 |
Moria curvrd forceps | FST | 11370-31 |
Moria fine forceps | FST | 11399-80 |
Dietrich bulldog clamp | FST | 18038-45 |
Animals | ||
C57BL/6J mice | Jackson labs | strain code 000664 |
CD-1 mice | Charles river | strain code 000664 |