このようなジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFNを)および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ(TALENS)などのデザイナーヌクレアーゼは非相同エンド入社(NHEJ)と相同組換え(HR)経路の両方をトリガすることによって、マウスの着床前胚のゲノムを変更するために使用することができます。これらの進歩は、正確な遺伝子改変マウスの迅速な生成を可能にする。
サイト固有のゲノム修飾(ノックアウト、ノックイン)を有するトランスジェニックマウスは、複雑な生物学的システムを解剖するためにだけでなく、ヒト疾患をモデル化し、治療戦略をテストするために極めて重要である。サイトのためのそのようなジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFNは)、デザイナーヌクレアーゼ、転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ(TALENS)、およびクラスタ化され、定期的に互いに間隔を短くパリンドローム反復(CRISPR)/ CRISPR関連(CAS)9システムの使用の最近の進歩特定のゲノム工学は、胚性幹(ES)細胞技術に依存することなく、実質的に任意の実験室種において急速標的ゲノム改変を実行する可能性を開く。ゲノム編集の実験は、一般的に研究者が定義したゲノム遺伝子座にヌクレアーゼ活性を指示するために、カスタムDNA結合ドメインの構造が続き、目的の遺伝子の中にデザイナーのヌクレアーゼ標的部位の同定で始まる。デザイナーヌクレアーゼプラスミドは、in vitroである</ em>は受精したマウス卵母細胞のマイクロインジェクションのためのmRNAを生成するために転写した。ここでは、受精したマウス卵母細胞にTALENのmRNAの直接注入の対象となるゲノム改変を実現するためのプロトコルを提供する。
マウスは、トランスジェニック動物モデルを生成するためのこれまでで最も人気のあるプラットフォームである。マウス胚1-3の遺伝子工学のための多目的なツールボックスは、最近では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、デザイナーヌクレアーゼに基づくゲノム編集アプローチによって4-6、転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を7,8に拡張されましたおよびクラスタ化され、定期的に互いに間隔を短くパリンドローム反復(CRISPR)/ CRISPR関連(CAS)9システム9。各FokIエンドヌクレアーゼ10月12日に連結されている2カスタム設計のタンパク質に基づくDNA結合ドメイン(ジンクフィンガータンパク質の配列をそれぞれ繰り返し変数をジ-残基(RVDS))のペアとしてZFNとTALEN機能。逆に、Cas9媒介DNA開裂の特異性は、CRISPR RNAをトランス活性によって提供される(また、単一のキメラRNA分子に組み合わせることができるcrRNAとtracrRNAは、ガイドRNAとも呼ばれる)11との複合体に作用するCRISPRタンパク質。
RVDSの定義された順序でTALENSは急速に13から17を選択するアセンブリ戦略の多数の個々の実験者によって構築することができる。 CRISPR/Cas9しかしガイドRNA-DNA結合の特異性は、まだ完全に18,19を解決しない、デザイナーヌクレアーゼのさらに少ない労働集約的な世代をお約束します。カスタムのZFNの生成は、これまで専門的な学術の研究室、およびこのようなサンガモBiosciences社とシグマCompoZrサービスとして、商業的な供給に限定されていた。
一般的には、デザイナーのヌクレアーゼで編集ゲノムは続いて非相同末端結合(NHEJ)または相同組換え(HR)DNA修復機械10,12を引き付ける定義されたゲノム遺伝子座、で二本鎖切断(DSB)を導入することを目指しています。 DSBのNHEJ媒介修理は、多くの場合、修理の現場に近接して挿入および欠失の導入になる。このようにNHEJリペアC遺伝子タンパク質コード配列の4,7,9内のフレームシフト変異を導入することにより標的遺伝子の機能をノックアウトするために利用される。代替的に、定義された追加又は遺伝情報の交換は、設計者ヌクレアーゼと共にDNA供与体を提供することによって達成することができる。 DNA供与体は、このようにHRによってDSB修復のための鋳型としての標的遺伝子座と相同な領域によって隣接治験設計のDNA配列を含む。両プラスミド5,6,20及び一本鎖オリゴヌクレオチド8,9,21正常ドナーとして使用されてきた。 NHEJ – ノルHR媒介ゲノム編集のいずれも、全体的な遺伝的構造を乱すことなく、塩基配列のわずかな変更を作成するためのこれらの戦略に特に適していますマウス胚のゲノム中に、選択マーカーの導入を必要とする。
このプロトコルでは、ゲノム編集のためのすべての基本的な手順を説明しますTALENSを使用して、マウスの胚。これらは、胚移植のための5)の外科的処置、受精したマウス卵母細胞へのTALEN mRNAの4)マイクロインジェクション、3)TALEN mRNAのインビトロ合成 、2)ゴールデンゲートによるTALENSの建設は13のクローンを作成、TALEN標的部位22の1)識別を含む創始動物におけるTALEN誘発される突然変異誘発、および6)分析。我々はTALEN mRNAのマイクロインジェクションとNHEJ誘発の挿入/削除の創設者のスクリーニングに焦点を当てています。この目的のために我々はプラスミドとして、マウス胚へのマイクロインジェクションのためのTALEN mRNAのin vitro合成にトランスフェクトされた場合、哺乳動物細胞の両方の発現を可能にする二官能TALEN構成物を生成した。これらの構築物は、ヘテロ二量体のFokIに融合し切り詰められた物語のバックボーン23は、哺乳動物細胞における最適なゲノム編集のために24,25のドメインからなる。このプロトコルは、他のデザイナーのヌクレアーゼのマイクロインジェクションのために、またはデザイナーのヌクレアーゼの組み合わせ注射のために採用することができるドナー構築物(DNA供与体の設計はWefers らにより優れた技術刊行物に記載されている。26,27)。
倫理的な声明
全ての動物実験は、カントンチューリッヒのカントン獣医局のガイドラインと規則に従って行った。
デザイナーヌクレアーゼ主導のゲノム編集アプローチが大幅にそれぞれのゲノム10,12のターゲット変更の影響を受けやすい種の範囲を拡大した。マウスでは、遺伝子標的ES細胞では、20年以上のための標準的な技術である;ラットES細胞におけるいくつかの最近の成功があったが、しかしながら、それは、マウス以外の種由来のES細胞に適応することが困難であることが証明されている。でも、このようなEUCOMM、KOMPとしてコンソーシアムが提供する「既製」遺伝子標的マウスES細胞クローンの利用可能性を持つ、またはNorCOMM 3ゲノム編集ZFNとTALENによることができる修正のスペクトルに関して、より高い精度と柔軟性を提供しますマウスゲノムに導入した。ヌクレアーゼ媒介変異を有する創始動物は、常に、ES細胞の胚盤胞の注入に起因するキメラの場合ではない、高度生殖系列有能4-6,20,21、ように見える。このように、DESの特定の場合に微量注入中ignerヌクレアーゼは、ターゲットを絞ったゲノム修飾を有する新たなマウス系統の大幅に高速生成をもたらすことができます。
ZFNとTALENの注入によるノックアウトマウスの正常な発生は、注入されたヌクレアーゼペアの活性に大きく依存。 TALENSは、生物の数の遺伝子の広い範囲を標的に高い成功率を有することが示されている;しかしながら、最近の研究は、TALEN結合はシトシンメチル30,31に感受性であることを示唆しているので、新たに生成されたヌクレアーゼ対は、例えばTALENSでのpCAG-T7ベクターにクローン化し、例えば、NIH-3T3または神経などのマウス細胞株に一過性にトランスフェクトすることができるある程度のマウス胚のクロマチン状態を模倣-2aは、。ここで、ヌクレアーゼ活性が従来mRNA合成およびマイクロインジェクションのセクション5で説明されるようにT7エンドヌクレアーゼアッセイまたはPCR産物の制限消化を用いて推定することができる。我々は尊敬に興味のあるゲノム領域の塩基配列決定を推奨アイブ細胞株およびマイクロインジェクション実験に使用したマウス株。
マウスの受精卵では、異なるTALENまたはZFNペアが異なるmRNA濃度で最適に動作するため、マイクロインジェクションし、ヌクレアーゼmRNAの最適な作用濃度は、実験的に決定する必要があります。高すぎる胚致死性をもたらすことができるのに対して、ヌクレアーゼペアに応じて、濃度が低すぎるのない切断が発生します。ヌクレアーゼの対に応じて、我々は、2 ngの/μlの200μgの/ ulのと同じ高程度の低い全mRNA濃度を使用して成功を収めている。これらの効果は、細胞培養および胚の生存および標的遺伝子座の変形速度の両方を経験的に決定する必要があるため、ヌクレアーゼの濃度で最適な実験から予測することは困難である。
高活性ZFNまたはTALENは顕微注入胚の1細胞期を超えて、その標的配列を切断し、このように変異誘発ANの複雑なパターンを引き起こす可能性があります創設者におけるDモザイク。我々は、他の4つのファウンダー( 図5C)3つ以上の異なる突然変異対立遺伝子を観察した。これらの創立者からの新しいマウス系統を確立するときにこのように、子孫は慎重に消化アッセイは、未定義の変異が存在するのみであるという証拠を提供するので、有利な変異の存在のために配列決定することによりスクリーニングされるべきである。
批判の一つは、頻繁にZFNとTALENシステムに対して有声音これらのヌクレアーゼはまた、標的部位に類似しているゲノム中にどこかに存在する配列を切断することができるという可能性である。このようなオフターゲット効果は、ホモ二量体のFokIドメインを使用して初期の世代の試薬 を用いて観察されており、ヘテロ二量体構築物は、オフターゲット効果25を軽減するために設計されていた。潜在的なオフターゲット部位は、 インシリコ 32,33 にある程度予測PCRおよび配列決定によりスクリーニングすることができる。明らかな利点のOfはマウスよりもむしろ細胞株を生成するためのZFNとTALENSを使用して、選択した野生型株にいくつかの戻し交配を行うことにより、所望のゲノム改変にリンクされていない標的変異をオフに除去する可能性がある。創始マウスの多数の分析のために、ヌクレアーゼ標的遺伝子座から、およびインシリコで生成されたPCR産物の次世代ディープシークエンシングは、オフターゲット遺伝子座がPCR産物の消化アッセイに別の定性的および定量的な読み出しを提供するかもしれないと予測した。
このプロトコルに記載の生殖補助技術は、C57BL/6J又はB6D2F1としてマイクロインジェクション実験のために使用される標準的なマウス系統のために最適化される。このような近交系株のような異なる起源のマウスは、原則的にゲノム編集アプローチを使用することができ、特定の研究課題に適し遺伝的背景を提供することがあります。このような過剰排卵などの生殖補助技術の性能はprediすることができます株34〜36の数CTEDが、ヌクレアーゼマイクロインジェクションのための胚の十分な数を得るために、非標準の株についてさらなる最適化が必要になる場合があります。
ZFNとTALENのほかに、そのようなRNA誘導CRISPR/Cas9システム9,37,38などの新しいデザイナーヌクレアーゼは現在、ゲノム編集アプリケーションのために導入されている。ここで説明する創始動物のマイクロインジェクションおよび分析のためのすべてのメソッドもCRISPR/Cas9ゲノム編集の将来のモードにも適用可能である。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、優れた技術支援のためのモニカTarnowska、コーネリアアルブレヒトとエワSkoczylasに感謝したいと思います。この研究は、PPへのSNF SinergiaグラントCRSI33-125073によって資金を供給された。
BsaI | NEB | R0535S or L |
Esp3I | Thermo Scientific | ER0451 |
T4 Ligase | NEB | M0202S or L |
Spectinomycin | Sigma | S0692-1ML |
Ampicillin | Sigma | A0166 |
X-Gal | Sigma | B4252 |
IPTG | Sigma | I6758 |
Plasmid-Safe nuclease | Epicentre | E3101K |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 |
QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 |
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit | Invitrogen | AM1345 |
NucAway Spin Columns | Invitrogen | AM10070 |
RNaseZAP | Sigma | R2020-250ML |
NorthernMax Formaldyde Load Dye | Invitrogen | AM8552 |
RNA Millennium Markers | Invitrogen | AM7150 |
10x TBE buffer | Thermo Scientific | B52 |
T7 endonuclease | NEB | M0302S or L |
pGEM-T EasyVector System I | Promega | A3600 |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S-7563 |
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG) | Sigma | G4877 |
human chorionic gonadotropin (hCG) | Sigma | CG5 |
M2 embryo culture medium | Sigma | M7167 |
M16 embryo culture medium | Sigma | M7292 |
Mineral oil, embryo tested | Sigma | M8410 |
Ketamine | CentraVet | Ket 201 |
Xylazine | Sigma Aldrich | 46995 |
Equipment/Tools | ||
Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200) | Nikon | |
Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF) | Narishige | |
Embryo holding capillaries | Sutter instruments | B100-75-10 |
Embryo injection capillaries | Narishige | GD-1 |
Capillary puller (for example Sutter P97) | Sutter instruments | |
Microforge (for example Narishige MF-900) | Narishige | |
Walton skin scissors | FST | 14077-10 |
Surgical scissors | FST | 14041-10 |
Surgical probe | FST | 10140-03 |
Reflex wound clip system (9mm) | FST | 12031-09 |
Reflex wound clips (9mm) | FST | 12032-09 |
Dumont fine forceps 5 | FST | 11254-20 |
Moria curvrd forceps | FST | 11370-31 |
Moria fine forceps | FST | 11399-80 |
Dietrich bulldog clamp | FST | 18038-45 |
Animals | ||
C57BL/6J mice | Jackson labs | strain code 000664 |
CD-1 mice | Charles river | strain code 000664 |