Summary

A Single-fly test voor foerageergedrag in<em> Drosophila</em

Published: November 04, 2013
doi:

Summary

In deze video artikel beschrijven we een geautomatiseerde test om het effect van honger of verzadiging op olfactorische afhankelijke voedsel zoekgedrag meten de volwassen fruitvlieg Drosophila melanogaster.

Abstract

Voor veel dieren, honger bevordert veranderingen in de olfactorische systeem op een manier die de zoektocht naar geschikte voedselbronnen vergemakkelijkt. In deze video artikel beschrijven we een geautomatiseerde test om het effect van honger of verzadiging op olfactorische afhankelijke voedsel zoekgedrag meten de volwassen fruitvlieg Drosophila melanogaster. In een lichtdichte doos verlicht door rood licht dat onzichtbaar is voor fruitvliegjes, een camera gekoppeld aan aangepaste data-acquisitie software bewaakt de positie van zes vliegen tegelijk. Elke vlieg beperkt zich tot lopen in individuele arena's met een levensmiddel geur in het centrum. Het testen arena's rusten op een poreuze vloer die functies geur stapeling te voorkomen. Latentie om de geur bron, een metric die olfactorische gevoeligheid onder verschillende fysiologische staten weerspiegelt vinden, wordt bepaald door software-analyse. Hier bespreken we de kritische mechanica van het runnen van deze gedrags-paradigma en betreft specifieke aspecten met betrekking tot vliegen loading, geurcontaminatie, test temperatuur, kwaliteit van de gegevens en statistische analyse.

Introduction

Staten van de honger bevorderen twee soorten appetitieve gedrag: voedsel zoeken en voedselconsumptie 1. Deze eenvoudige gedrags assay is bruikbaar voor de studie van chemotactische gedrag geassocieerd met het voederen 2,3. In het bijzonder, het tracks vliegen positie, loopsnelheid en latentie tot het lokaliseren van een levensmiddel geur doelwit. Latentie van voedsel bevinding dient als maatstaf voor het meten van veranderingen in de gevoeligheid van geur detectie systeem van de vlieg stroomafwaarts van veranderingen in de interne appetitief staat. Een handmatige versie van deze test is eerder gebruikt om aan te tonen GABA-B receptor signalering is belangrijk voor geur lokalisatie gedrag bij volwassen vliegen 3. De huidige geautomatiseerde versie van de test was instrumenteel in de studie van hoe kort neuropeptide-F (SNPF) signalering hervormt het olfactorische kaart in Drosophila en invloeden appetitive gedrag 2.

Het testen wordt uitgevoerd in een donkere, temperatuur en vochtigheid ruimte. Digitaalvideocamera's boven de helder acrylaat testen platen set bijhouden vliegen verlicht door 660-nm LED-verlichting. Informatie van de camera wordt verwerkt in real-time door een computer gestationeerd naast het testgebied. We maken gebruik van data-acquisitie software om de coördinaten van vliegen posities opnemen en opslaan tijdens de testperiode.

In dit paradigma, wordt het onderwerp losgelaten in een arena die een levensmiddel geur in het midden bevat, de geur object creëert een voedsel geur gradiënt in de arena dat voedsel zoekgedrag induceert in de vlieg. Een soortgelijke geur zoekprotocol is toegepast in de richting van de studie van chemosensation in enkele Drosophila larven 7. Terwijl andere gedrags-testen zoals de vier-veld olfactometer 4,5 of t-doolhof 6 evalueren geur aversie of attractie gedrag, wordt dit paradigma best geschikt voor olfactorische gevoeligheid en chemotaxis gedrag te evalueren.

Een aantal belangrijke voordelen te begeleiden deze ASSAy. Ten eerste, het maakt het mogelijk snelle verwerving van grote datasets, omdat het verzamelen en analyseren van gegevens meestal worden geautomatiseerd. Ten tweede, deze test isoleert en meet het gedrag van enkele vliegen, zodat het niet langer sociale olfactorische signalen die hun gedrag kunnen beïnvloeden. Ten derde, de eenvoud van het protocol en eenvoudige experimentele design maken de test efficiënt en gemakkelijk om anderen te onderwijzen.

Daarnaast kan deze test worden gebruikt voor het verder onderzoeken neurale circuits onderliggende voedsel zoekgedrag door het te combineren met de uitgebreide genetische toolkit beschikbaar Drosophila melanogaster 8. Gerichte expressie van transgenen die stilte of prikkelen neuronen kan worden bereikt met instrumenten zoals het GAL4-UAS-systeem evenals de UAS-shibire ts1, UAS-tetanus-toxine, en UAS-TRPA1 (B) transgenen 9-12.

Protocol

1. Fly Collection en uithongering Achterzijde van de experimentele vliegen onder gecontroleerde temperatuur en vochtigheidsgraad (bv. 21 ° C, 50-60% relatieve vochtigheid) op een 12-uur licht / donker-cyclus. Verzamel vrouw vliegt op de dag van eclosion en leg ze, samen met 4-5 mannetjes, in nieuwe voeding flesjes (maximaal 30 per flacon). Leeftijd vliegt 2-5 dagen. Bereid de kamers voor vlieg verhongering. Duw een weefsel (4,8 x 8,4 inch) tot aan de bodem van een lege p…

Representative Results

De data analyse software en inrichting, waarvan een voorbeeld is te zien in figuur 1, worden gebruikt om de prestaties elk vlieg tijdens de 10 min proef toetsen aan een reeks criteria analyse. De volgende criteria worden gebruikt om te bepalen of de gegevens van elke vlieg zal worden gebruikt voor data-analyse en zijn ontworpen om de vliegen die niet in staat om het voedsel te zoeken taak uit te voeren als gevolg van letsel, ziekte, stress of gebrek aan motivatie zijn te elimineren. <p class="jove_c…

Discussion

In dit protocol beschrijven we een stap-voor-stap procedure voor het eten zoekgedrag assay. Naast voedsel gerelateerde geuren kan ook worden aangepast voor de studie van het vermogen van de vlieg andere geur objecten lokaliseren. Bijvoorbeeld kan het worden toegepast naar de studie van mate lokalisatie gedrag bij mannelijke vliegen 3 Er zijn verschillende aanvullende overwegingen voor dit protocol dat wij hier vermelden over deze procedure.:

Ten eerste, de opfok temperatuur bepaal…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies voor onderzoek naar JWW van het National Institute of Health (R01DK092640) en de National Science Foundation (0.920.668).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Apple Cider Vinegar Spectrum commercially available
Agarose, Type VII Sigma-Aldrich A0701 low gelling temperature agarose
Acrylic Testing Plate custom Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements.
LabVIEW V.8.5 National Instruments 776670-09 platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking–Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking–Six zones.vi" to run.
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6 Wavemetric, Inc. platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking–Six Zones
Basler scA1390-17fm National Instruments 779980-01 Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com
8 mm lens National Instruments 780024-01 Lens for Basler Digital Camera
Ground Glass Diffuser Plate Edmund Optics custom Diffuses light, 25 cm x 30 cm
US Std. No. 100 Fischer Scientific 04-881X Sieve with nominal opening of 150 μm
Lighting Option 1
LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) Spectra West BL47192 a simpler but more expensive lighting option.
Power Supply for LED Backlight Spectra West
Lighting Option 2
660 nm LEDs Superbrightleds RL5R1330 Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel)
Linear DC Power Supply GW Instek GPS-1830D Power supply for LED Panel
Solderless Breadboard Digikey 922354-ND Breadboard for LEDs

References

  1. Dethier, V. G. . The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding. , (1976).
  2. Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145, 133-144 (2011).
  3. Root, C. M., et al. A presynaptic gain control mechanism fine-tunes olfactory behavior. Neuron. 59, 311-321 (2008).
  4. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
  5. Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).
  6. Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 708-712 (1974).
  7. Fishilevich, E., Domingos, A. I., Asahina, K., Naef, F., Vosshall, L. B., Louis, M. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr. Biol. 15, 2086-2096 (2005).
  8. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  9. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
  10. Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
  11. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O’Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  12. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).

Play Video

Citer Cet Article
Zaninovich, O. A., Kim, S. M., Root, C. R., Green, D. S., Ko, K. I., Wang, J. W. A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e50801, doi:10.3791/50801 (2013).

View Video