Способ синтеза титана и ванадия противораковых агентов воздушных чувствительных описано, вместе с оценкой их цитотоксической активности по отношению к клеточной линии рака человека со стороны МТТ.
Титана (IV) и ванадий (V) комплексы весьма эффективными противораковыми агентами. Проблема в их синтезе относится к их гидролитической нестабильности, поэтому их получение должно проводиться в инертной атмосфере. Оценка противоопухолевой активности этих комплексов может быть достигнуто с помощью МТТ-анализе.
МТТ-анализ представляет собой колориметрический анализ жизнеспособности на основе ферментативного восстановления молекулы МТТ до формазана, когда она подвергается воздействию жизнеспособных клеток. Исход сокращения является изменение цвета молекулы МТТ. Измерения оптической плотности относительно контроля определить процентное соотношение оставшегося жизнеспособные раковые клетки после их обработки с различными концентрациями тестируемого соединения, что в переводе на соединения противоопухолевой активности и ее IC 50 значений. МТТ является широко распространенным в цитотоксичности исследований из-за его точности, быстроты и относительной простотой.
При этом мы заранеенаправил подробный протокол для синтеза чувствительны воздуха металла на основе наркотиков и измерений жизнеспособность клеток, включая подготовку клеточных пластин, инкубации соединений с клетками, измерения жизнеспособности с помощью МТТ, и определение IC 50 значений.
Химиотерапия остается одним из основных курсов лечения, применяемых в клинике для различных раковых заболеваний, и, следовательно, огромное количество исследований проводится по всему миру с целью разработки новых и усовершенствованных противоопухолевых препаратов. Такие исследования в основном начинаются в химическом уровне, с проектирования и подготовки соединений, а затем биологической оценки цитотоксических свойств в пробирке. Жизнеспособность клеток может быть определена с помощью различных анализов, которые обеспечивают информацию о клеточной активности 1-2.
Цисплатин является примером комплекса платины, который широко используется в качестве химиотерапевтического препарата, который считается эффективное лечение в основном для яичек и яичников 3-4. Тем не менее, его узкий диапазон деятельности и серьезные побочные эффекты вызывают исследования других мощным комплексов переходных металлов 5-8. В частности, титана (IV) и ванадий (V) комплексы показали обнадеживающие результаты высокой активности и уменьшениетоксичность 9-16. Ti (IV) комплексы были первыми, чтобы войти клинические испытания после цисплатин из-за этих свойств, однако они не смогли испытания из-за трудностей разработки и гидролизного нестабильности. Существует, таким образом ток необходимость в разработке улучшенных производные этих комплексов металлов, которые могут сочетающих высокую противоопухолевую активность с водостойкость 15,17-21.
Проблема в подготовке Ti (IV) и V (V) комплексы относится к гидролитической нестабильности реагентов-предшественников, поэтому инертная атмосфера должна быть сохранена. Получение (V) соединений Ti (IV) и V проводится в атмосфере N2 или Ar условий в перчаточном боксе, или с использованием методов Шленка строки.
Один общий метод для оценки противораковой активностью на основе MTT (3 – (4,5-диметилтиазолил) -2,5-дифенилтетразолийбромид) анализ. Этот анализ является колориметрический жизнеспособность анализ, который был представлен в 1983 году Mosmann22. Это очень хорошо изучены и характеризуется, и это считается весьма эффективным при оценке эффективности новых цитотоксических соединений из-за его точности, быстроты, и его способность быть применены на различных клеточных линиях. Это жизнеспособность анализ основан на изменении цвета молекулы МТТ, когда она подвергается воздействию жизнеспособных клеток. Измерение оптической плотности, которое пропорционально числу жизнеспособных клеток, а по сравнению с необработанными контрольными, позволяет оценку ингибирования роста клеток возможностей тестируемого соединения.
МТТ колориметрический анализ проводят в формате 96-луночного планшета 23. Эти клетки могут потребовать предварительной инкубации в лунки перед добавлением испытуемого препарата. Времена предварительной инкубации может варьировать от 0-24 часов в зависимости от свойств клеточных линий. Клетки обычно воздействию препарата на 24-96 ч в зависимости от активности лекарственного средства. Раствор МТТ затем добавляют к обработанных клеток, где YELLМТТ вл снижается до фиолетового формазана различными митохондриальных и цитозольных ферментов, которые действуют в жизнеспособных клеток (фиг. 1) 24. Молекула МТТ не уменьшается мертвых клеток или эритроцитов (метаболически неактивные клетки), клеток селезенки (покоящиеся клетки) и лимфоциты конканавалин А-стимулированной (активированные клетки) 22. После 3-4 часов инкубации МТТ формазана выпадает в осадок. Формирование формазана начинается после 0,5 ч инкубации но для достижения оптимальных результатов лучше подвергать клетки МТТ в течение по крайней мере 3 ч. 22. Следовательно, выращивание среду удаляли и формазана растворяют в органическом растворителе, предпочтительно изопропанол 25, хотя ДМСО могут быть также использованы 26. Ликвидация среды имеет решающее значение для достижения точных результатов, поскольку фенола красного, который широко распространен в среде роста, и осаждения белков может создавать помехи для измерения оптической плотности 25. Когда FormaРаствор зан достигает однородной, оптическая плотность раствора измеряют с использованием микропланшет-ридера спектрофотометра. Поглощение при 550 нм прямо пропорциональна числу клеток в диапазоне 200-50,000 клеток на лунку, и таким образом очень малые количества клеток могут быть обнаружены 22. Оптическую плотность указывает на количество жизнеспособных клеток, которые остались после обработки лекарственным средством и по сравнению с оптической плотности контрольных клеток, которые не подвергались воздействию препарата. Анализ результатов по соответствующим программным обеспечением обеспечивает (концентрация ингибирования; 50%) IC 50 значения и их статистические ошибки на основе нескольких повторений измерения.
МТТ является широко распространенным в цитотоксичности исследований для скрининга новых противораковых соединений, благодаря своей точности и относительной простоты. Однако, когда с помощью МТТ-анализа, который зависел от ферментативной реакции, необходимо учитывать, что различные ингибиторы ферментов может повлиять на снижение МТТ ANг привести к ложным результатам 27. Кроме того, МТТ не дает никакой информации о молекулярном механизме цитотоксической активности препарата 2.
Способ, описанный в этой рукописи сочетает в себе химический синтез с биологического анализа жизнеспособности клеток. Как и с любым биологических методов, касающихся жизнеспособных клеток, жизненно важно работать в ламинарным укрытием, и поддерживать стерильные условия, в том числе с…
The authors have nothing to disclose.
Финансирование было получено от Европейского исследовательского совета при рамочной программы Европейского сообщества Седьмой (FP7/2007-2013) / не ERC соглашение Грант не [239603]
Reagent/Material | |||
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
Hexane AR | Gadot | 830122313 | Dried using a solvent drying system |
HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
Isopropanol AR | Gadot | 830111370 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
MTT | Sigma-Aldrich | M5655-1G | |
Penicillin/streptomycin antibiotics | Biological Industries | 03-031-1B | |
RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine | Sigma-Aldrich | R8758 | |
RPMI without phenol red | Biological Industries | 01-103-1A | |
Tetrahydrofuran (THF) AR | Gadot | 830156391 | dried using a solvent drying system |
Ti(OiPr)4 | Sigma-Aldrich | 205273-500ML | moisture sensitive |
Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-052-1B | |
VO(OiPr)3 | Sigma-Aldrich | 404926-10G | moisture sensitive |
Equipment | |||
12-channel pipette 30-300 μl | Thermo Scientific | ||
12-channel pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
75 cm2 flask | NUNC | 156472 | |
96-well plate with lid (flat bottom) | NUNC | 167008 | |
CO2 Incubator | Binder | APT.line C150 | |
Counter chamber | Marienfeld-Superior | 650030 | |
Eppendorf vial | KARTELL | ||
Glove box | M. Braun | ||
Laminar flow hood | ADS LAMINAIRE | OPTIMALE 12 | |
Microplate reader spectrophotometer | Bio-Tek | El-800 | |
Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
Pipette 20-200 μl | Finnpipette | ||
Pipette 5-50 μl | Finnpipette |