記事では、ラットの腸から無細胞マトリックスを製造するための方法論を説明します。腸の足場の導出は、細胞生物学および薬物検査幹、組織工学における将来の用途のために重要である。
成功した組織工学は、in vitroまたはin vivoで適切な細胞を有する足場の組合せを含む。足場は、合成または天然由来の組織/器官に由来することができる。後者は、脱細胞化と呼ばれる技術を用いて得られる。脱細胞化は、物理的、化学的、および酵素的方法の組合せを含み得る。この技術の目的は元の組織のマクロおよびマイクロアーキテクチャを維持しながら、すべての細胞の痕跡を除去することである。
腸組織工学はこれまでネイティブ臓器の複雑なアーキテクチャを複製しない比較的単純な足場を使用しています。この論文の焦点は、ラット小腸のための効率的な脱細胞化技術を説明することである。小腸の単離血管の接続の維持を確実にするように記載されている。ウコン細胞を除去する化学的および酵素的ソリューションの組み合わせ足場の管面に絨毛-クリプト軸を維持し、STも着手している。最後に、適切な特性のために製造足場の評価が議論されている。
組織工学(TE)は免疫抑制および臓器不足の問題をバイパスして、臓器移植への治療選択肢を提供します。 TEは最近、両方の大人3,4と子供5に、例えば膀胱1、尿道2、気管などの臓器に代えて、クリニックに成功したアプリケーションを持っていた。
組織工学臓器を構築することは、適切な細胞と足場の組み合わせを必要とする。足場は、天然由来( 例えば、コラーゲン)を用いて調製及び合成( 例えば、ポリ-L-グリコール酸、PLGA)することができる材料、または天然の器官および組織の脱細胞化することにより得られる。腸TEのためにこれまで使用されている足場は、主に6-13(ポリ-L-グリコール酸およびポリ乳酸)脱細胞化(小腸粘膜下組織)または合成のいずれかであった。これらの生体材料は、マクロおよびマイクロアーキテクチャの両方で非常に単純である組織工学、腸が臨床的に翻訳される場合には理想的ではないかもしれません。腸に最適な生体材料は、を支援するために、腸壁の層と腔側に絨毛-クリプト軸を反映するために、ホストの血液供給に接続することができ先天的血管樹、異なる特性を持つ階層型管状の壁を持っている必要があります上皮幹細胞による再増殖。
脱細胞化は、元のアーキテクチャ14を維持しながら、全体の器官から細胞を除去することによって足場を生成する新規な方法論である。これは、臓器の構造を複製するだけでなく、細胞外マトリックス(ECM)を助ける細胞増殖および分化の中に埋め込まれた化学的手がかりを含まないだけでなく、足場は既に、既存のが好ましい。 2008年に死体気管に、患者自身の細胞を播種し、14を脱細胞化し、若者にメイン左気管支を置き換えるために移植した<sup> 3。それ以来、グループの数は、大小の動物の心臓15、肝臓16,17、および肺18〜20のための脱細胞足場の生産を報告している。
我々はまた、小腸脱細胞足場21を生成するために、同じ方法論を適応している。本明細書に記載された方法の目的は、このような血液供給、元の組織、ならびに腸管腔における陰窩 – 絨毛軸の微視的構造の巨視的特性を維持脱細胞化された腸の行列を生成することである。我々は、この方法論は、最終的に脱細胞化の効率を改善する他の器官のために採用することができると考えている。
この実験のセットアップで最も困難なステップは、SMAのカニューレ挿入し、無菌性の確立と維持を必要とする。壁を破壊することなく、げっ歯類ではSMAにカニューレを挿入することにより、容器のサイズと位置に非常に困難な場合があります。代替的に、縫合糸は、SMAにプラスチックカニューレを導く、遠位大動脈自体のカニューレ挿入に続いて、前のSMA原点を近位大動脈の周りに配置されてもよい。脱細胞化中に乏しいカニューレの配置と高流量の組合せは、血管アクセスを失うことを生じ得る。無菌性は、小腸に存在する細菌叢の量に起因する大きな課題となっている。収穫後、PBS / AAで洗浄することは非常に重要であり、糞便や破片の兆候は、内腔から除去されなければならない。無菌性が達成された場合には、UV殺菌、次のインキュベーターにDMEMでファルコンチューブ内の足場の一部を配置する指標である必要があります。際に細菌のコロニー形成のため、メディアはその色が赤から黄色に回しでpHが変化します。これに対処するため、他のUVサイクルが助言だけでなく、PBSで洗浄は抗生物質/抗真菌剤を高濃度に含有している。
血管および静脈アクセスの両方に足場を得ることが可能変更は下大静脈(IVC)と同様に、SMAにカニューレを挿入することであろう。静脈および血管の側から脱細胞化は、すべての3つの解決策を断続的に試みるべきである。連続的な脱細胞化は、両側の正の圧力を有することによって毛細管を破裂することがある。
長年にわたり、in vitroおよびin vivo 6,9,12 に異なる細胞足場の組み合わせを使用して、腸のTEの取り組みの数があった。仕事の大部分はI型コラーゲンでコーティングした管状6,7,13,22不織布95%PGA-5%PLGA足場材を用いて行われた。腸では、次の種まき上皮オルガノイド単位(OU)およびマウスの大網への移植の期間、彼らはその後tubularizedすることができ、内側に外側上皮に対する筋肉に嚢胞を形成している。しかし、これらの足場の設計において、多孔性とシンプルさは、このようなバイオリアクターのいるようなインビトロ環境における人工腸の大部分を生成するために許可していません。さらに、さらに、受信者に接続することができ先天的血管網の欠如は、臨床、翻訳のために、この足場の使用を制限する。 PGA-PLGA足場を用いた実験に加えて、他のグループは、腸管の複雑さを複製しない、どちらもコラーゲンやSIS足場を、使用している。 SISは、特に腸組織工学の唯一の以前公開された方法論であり、機械的安定性を提供し、リードしながら、細胞増殖を促進するための脱細胞化スカフォールドの能力を実証し、150以上の医療現場で使用されている無免疫原性応答にING。しかし、適切なマクロとマイクロアーキテクチャの欠如は、腸のTE目的9-11,23のための「使用中悪い結果につながっている。
我々が説明した脱細胞化手法の利点は、腸の幹細胞ニッチで再増殖のための適切な環境を表すような管腔陰窩 – 絨毛アーキテクチャとして微視的特性の保存が含まれる。巨視的局面では、階層的な血管網の存在はTE-21腸の全ての層に栄養と酸素の供給を可能にし、受信者に添付ファイルを有効にします。しかも、コラーゲン、エラスチンおよびglyocosaminoglycansなどのECM成分のメンテナンスは、機械的特性だけでなく、細胞増殖および分化を導くだけでなく、重要な役割を有している。最も重要なことは、脱細胞化方法論の能力は、大規模にスケールアップする同じ特性を維持しながらr個の組織はTEの臨床的翻訳のために重要な特徴である。
血管網との自然な腸のマトリックスの開発は、ホストに接続することができ、人工腸の大きなセグメントを作成することができます。
The authors have nothing to disclose.
著者は、このプロトコルの開発に彼らの助けのための再生医療ウェイクフォレスト大学に感謝します。我々はグレートオーモンドストリート病院慈善財団エウジェニオリッタ(スイス·ジュネーブ)、医学研究評議会、英国の外科医のロイヤルカレッジ、スパークス小児医療チャリティー、英国英国外務省/からの補助金によって支援を認める米国は、Cellコラボレーション賞、ミタル研究基金幹。また、母子保健研究所で小児外科部門の得られた組織工学研究室の改修助成金のために王立協会/ウォルフソン財団に感謝したいと思います。 PDCとSEがグレートオーモンドストリート病院子供チャリティでサポートされています。
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
Sodium chloride | |||
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |