Una Metodología Descelularización para la Producción de una matriz Intestinal Natural acelular
Summary
El artículo describe una metodología para la producción de una matriz acelular de intestino de rata. La derivación de los andamios intestinal es importante para futuras aplicaciones en la ingeniería de tejidos, biología de células madre y las pruebas de drogas.
Abstract
El éxito de la ingeniería de tejidos implica la combinación de los andamios con las células adecuadas in vitro o in vivo. Los andamios pueden ser sintéticos, de origen natural o derivados de tejidos / órganos. Este último se obtienen usando una técnica llamada descelularización. Descelularización puede implicar una combinación de física, química, y métodos enzimáticos. El objetivo de esta técnica es eliminar todos los restos celulares mientras se mantiene la arquitectura micro-macro y del tejido original.
Ingeniería de tejidos intestinales ha utilizado hasta ahora andamios relativamente simples que no replican la compleja arquitectura del órgano nativo. El objetivo de este trabajo es describir una técnica eficiente para descelularización rata intestino delgado. El aislamiento del intestino delgado a fin de garantizar el mantenimiento de una conexión vascular se describe. La combinación de soluciones químicas y enzimáticas para eliminar las células nocst preservar el eje cripta de vellosidades en la cara luminal del andamio se establece también. Finalmente, se discute la evaluación de los andamios fabricados para las características apropiadas.
Introduction
La ingeniería de tejidos (TE) es una alternativa terapéutica para el transplante de órganos, pasando por alto los problemas de inmunosupresión y la escasez de órganos. TE ha tenido recientemente aplicaciones exitosas en la clínica, con el reemplazo de órganos como la vejiga 1, 2 uretra y la tráquea, tanto en los adultos y los niños 3,4 5.
La construcción de un órgano por ingeniería de tejidos requiere la combinación de un andamio con las células apropiadas. Un andamio se puede preparar usando de origen natural (por ejemplo, colágeno) y (por ejemplo, ácido poli-L-glicólico; PLGA) sintético materiales, o ser obtenida por el descelularización de órganos y tejidos nativos. Los andamios que se han utilizado hasta ahora para TE intestinal han sido principalmente ya sea descelularizado (submucosa del intestino delgado) o sintético (ácido poli-L-glicólico y ácido poli-láctico) 6-13. Estos biomateriales son muy simples, tanto en la arquitectura micro-macro y, quepuede no ser ideal si el intestino por ingeniería de tejidos ha de traducirse clínicamente. Un biomaterial óptima para el intestino debe tener un árbol vascular innata que puede ser conectado al suministro de la sangre del huésped, una pared tubular niveles con diferentes propiedades para reflejar las capas de la pared intestinal y un eje-vellosidades cripta en el lado luminal para ayudar con repoblación por las células madre epiteliales.
Descelularización es una metodología novedosa que produce andamios mediante la eliminación de las células de órganos enteros, mientras que el mantenimiento de su arquitectura original 14. Esto es preferible a las ya existentes andamios, ya que no sólo replicar la estructura del órgano, pero también contienen señales químicas integradas dentro de la matriz extracelular (ECM) que ayuda la proliferación y diferenciación celular. En 2008 una tráquea de cadáver fue descelularizados 14, se siembra con las propias células del paciente, y se trasplanta a reemplazar el bronquio principal izquierdo en un joven <sup> 3. Desde entonces, un número de grupos han informado de la producción de andamios descelularizados para el corazón 15, el hígado 16,17, y de pulmón 18-20 en animales pequeños y grandes.
También hemos adaptado la misma metodología para producir un pequeño andamio descelularizado intestinal 21. El objetivo del método descrito en el presente documento es para producir matrices intestinales descelularizados que mantienen las características macroscópicas del tejido original tales como el suministro de sangre, así como la arquitectura microscópica del eje cripta-vellosidad en el lumen intestinal. Creemos que esta metodología en última instancia, podría ser adoptada para otros órganos para mejorar la eficiencia de descelularización.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más difíciles en la creación de este experimento implican la canulación de la SMA y el establecimiento y mantenimiento de la esterilidad. Canulación de la SMA en roedores sin romper la pared puede ser bastante difícil debido al tamaño y posición de la embarcación. Alternativamente, una sutura puede ser colocado alrededor de la aorta proximal antes de la SMA origen, seguido de la canulación de la aorta sí mismo distalmente, la dirección de la cánula de plástico en el SMA. Durante descelularización una combinación de una mala colocación de la cánula y las altas tasas de flujo puede resultar en la pérdida del acceso vascular. La esterilidad es un problema importante debido a la cantidad de la flora bacteriana presente en el intestino delgado. Lavado con PBS / AA después de la cosecha es muy importante, y cualquier signo de la materia fecal o desechos debe ser retirado desde el lumen. La colocación de una porción del andamio en un tubo Falcon con DMEM en la incubadora después de la esterilización UV debe ser un indicador de si la esterilidad se ha logrado. En el casode la colonización bacteriana, los medios de comunicación va a cambiar el pH, con su color cambiante de rojo a amarillo. Para hacer frente a esto, más ciclos de UV se aconseja, así como el lavado con PBS que contiene una alta concentración de antibiótico / antimicótico.
Una posible modificación para obtener un andamio con acceso tanto vascular y venosa sería para canular la vena cava inferior (IVC), así como la SMA. Descelularización de los lados venosos y vasculares debe intentarse intermitentemente para todas las tres soluciones. Descelularización continua puede explotar en los capilares por tener presión positiva en ambos lados.
A través de los años ha habido un número de esfuerzos en intestinal TE utilizando diferentes combinaciones de células-andamiaje in vitro e in vivo 6,9,12. La mayor parte del trabajo se ha realizado utilizando tubulares no tejido 95% PGA-5% de PLGA andamios recubiertos con colágeno de tipo I 6,7,13,22. Después de la siembra con intestinalunidades epiteliales organoides (OU) y un período de implantación en el omento de ratones, que forman quistes con el músculo en el exterior y el epitelio en el interior que luego pueden ser tubulariza. Sin embargo, la porosidad y la simplicidad en el diseño de estos andamios no permite para la generación de grandes trozos de intestino artificial en un entorno in vitro, tales como la de un biorreactor. Además, la falta de una red vascular innata que se puede conectar al destinatario limita aún más el uso de este andamio para la traducción clínica. Además de los experimentos con los andamios de PGA-PLGA, otros grupos han utilizado colágeno o SIS andamios, ambos de los cuales no se replican la complejidad del tracto intestinal. SIS, en particular, es la única metodología anteriormente publicada de la ingeniería de tejidos intestinal y se ha usado en más de 150 entornos médicos, que demuestra la capacidad de los andamios descelularizados para proporcionar estabilidad mecánica y promover el crecimiento celular, mientras que el plomoING ninguna respuesta inmunogénica. Sin embargo, la falta de micro-arquitectura de macro-y apropiado, ha dado lugar a malos resultados en su "uso con fines TE intestinales 9-11,23.
Los beneficios de la metodología descelularización hemos descritos incluyen la preservación de las características microscópicas, tales como la arquitectura de las criptas-vellosidades luminal que representan un ambiente apropiado para la repoblación por el nicho de células madre intestinales. En el aspecto macroscópico, la presencia de una red vascular jerárquico será permitir la fijación al receptor, lo que permite el suministro de nutrientes y oxígeno a todas las capas de la TE-delgado 21. Lo que es más, el mantenimiento de componentes de ECM, tales como el colágeno, la elastina y glyocosaminoglycans tiene un papel importante no sólo para las características mecánicas, sino también dirigir la proliferación y diferenciación celular. Lo más importante, la capacidad de la metodología de descelularización a ser ampliado en grantejidos r mientras que el mantenimiento de las mismas características es una característica importante para la traducción clínica de la TE.
El desarrollo de una matriz intestinal natural con una red vascular permite la creación de segmentos más grandes de intestino artificial que puede ser conectado al host.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a la Wake Forest Institute de Medicina Regenerativa por su ayuda en el desarrollo de este protocolo. Reconocemos el apoyo de subvenciones de la caridad Hospital Great Ormond Street, la Fundación Eugenio Litta (Ginebra, Suiza), el Consejo de Investigación Médica, el Colegio Real de Cirujanos de Inglaterra, de las Sparks Médico Infantil Caridad, la Oficina de Relaciones Exteriores británica para el Reino Unido / EE.UU. Células Madre Premio Colaboración y el Fondo de Investigación de Mittal. También nos gustaría dar las gracias a la Fundación Real Sociedad / Wolfson para la concesión remodelación del laboratorio de ingeniería de tejidos obtenidos por el Departamento de Cirugía Pediátrica en el Instituto de Salud Infantil. PDC y SE son apoyados por la Caridad del Great Ormond Street Hospital de Niños.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
| Sodium chloride | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |
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