Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.
生成和血管病变的分析合适的动物模型是研究心血管疾病的基石,在产生病变形成的发病机制和新疗法的行动的重要信息。使用动脉硬化多发小鼠,病变感应的手术方法,和饮食改变的极大地提高,有助于疾病的发展和新的治疗药物的潜在机制的理解。
经典地,使用2-维组织学技术进行病变分析离体进行 。本文介绍的应用光学投影层析成像(OPT)动脉病变的三维定量。由于该技术是非破坏性的,它可以用来作为一种辅助标准的组织学和免疫组织化学分析。
内膜病变引起的线插入鼠标股骨艺术或结扎ERY而动脉粥样硬化病变由动脉粥样硬化的饮食ApoE基因缺陷小鼠产生的管理。
自体荧光使用发射OPT成像其次是互补的组织学和免疫组化分析病灶进行了检查。 OPT从底层血管壁明确区分病变。病变大小用面积法计算出在2维节,使损伤体积和最大截面积的计算中。使用OPT生成的数据是使用组织学获得的测量结果一致,证实了该技术的精确度和其作为一种补充(而不是替代),以传统的分析方法的潜力。
这项工作表明成像动脉粥样硬化和新生内膜病变OPT的潜力。它提供了一种快速,非常需要体外技术血管重塑的常规三维定量。
动脉损伤的形成是中央的高发病率和死亡率与心血管疾病相关联。损伤形成被认为是由一不受约束的炎症反应引起的动脉损伤2。动脉粥样硬化病变慢慢形成响应于慢性损伤动脉壁而再狭窄病变中迅速以下急性机械损坏(例如,支架植入后)。有助于动脉病变的发展的机制已经相当澄清通过使用适当的动物模型,通常是与相关的基因操作1结合。
病变大小和组成的分析已经经典很大程度上取决于体外 ,二维组织学(虽然这是改变与改进的方法的开发用于体内和离体检测和病变的小动物的分析<SUP> 3)。动脉损伤的组织学分析是劳动密集,耗时且提供3维结构的有限信息。例如,病变负担通常通过测量病变的横截面面积进行评估(无论是在随机选择的地点或在最大闭塞部位)。这提供了整体的病变负担一个不完整的分析。整个安装三维成像技术提供了可能解决这一问题,但令人惊讶的几个合适的方法已被描述。这可能是由于以主要的小鼠动脉这对单光子共聚焦显微镜太大而是用于磁共振成像(MRI)4和X射线计算机断层扫描(CT)5太小的尺寸。 体外 MRI微型CT应用和动脉粥样硬化病变的小鼠研究表明,他们提供有限的分辨率,即使在比较大的动脉。加入到这一点,需要相对较长的采集时间限制吞吐量(和提高扫描费用)4,6。
新的光学成像方式(如光学相干断层扫描3,7和光声断层8)发展提供了巨大的潜力,改善病灶成像在小鼠动脉。类似电位示由光学投影层析(OPT),其被开发以允许小鼠胚胎的分析。 OPT被设计图像标本范围从〜0.3-10毫米,直径9。透射成像记录一个半透明样品多色可见光的不透明度,并且可用于识别的解剖结构。光激发之后在来自内特定的波长( 例如 ,胶原,弹性蛋白)和样品中的外源性荧光团发射的成像记录发射。这也可以提供解剖信息(因为不同的组织成分所用的类型和自发荧光物种的密度不同当下)。此外,免疫反应性或基因表达的分布可以通过使用适当的荧光探针10来确定。对于任一成像模式(传输或发射),光被聚焦到一个电荷耦合器件,以允许迭代图像捕获作为样品旋转(通常为400张图像,0.9°增量)。这些可用于体积由标准层析重建方法(例如滤波反投影(使用锥算法)或迭代重建)的计算。
该视频展示了我们新的应用OPT进行快速,可量化的和具有成本效益的三维和动脉粥样硬化病变内膜的分析,如以前在柯比等 11描述。该技术被证明是适合于在三个常用模型定量损伤大小:(ⅰ)股动脉线损伤; (二)股动脉结扎,和(iii)膳食诱导的动脉粥样硬化中apolipoprotei否E缺陷(ApoE基因– / – )小鼠。
3维分析具有用于替换或添加到2维的组织学技术,仍然支撑大多数动脉损伤形成的调查的巨大潜力。在这里,OPT显示在小鼠动脉(与鼠股动脉大概代表,可以成功地使用这种技术来分析的最小的血管)。然而,它是,也适用于与动脉(和病变)来自其它物种,包括小到中等大小的人类血管使用;本集团已成功地使用这项技术来分析病变的兔主动脉(Bezuidenhout 等;未发表)。 OPT承诺更快的分析和增加的结构信息与传统的组织学比较,并具有不妨碍同时使用组织学和免疫组织化学技术的样品的随后的分析的优点。
使用OPT产生的图象,得到解剖细节,表示病变的形成部位和病变在这些区域的大小。在这些调查中使用的动脉可能接近的技术和图像质量分辨率的限制,因此由伪影(大概从旋转失准,不完整结算,反射/折射在琼脂糖顶点和聚焦的问题引起的)损害至一定程度。尽管这样,所要求的细节( 即 ,层血管壁)保持可辨别,因此该技术是对各层的量化非常有用的。事实上,图像可以迅速且可再现量化,以提供病变和管腔体积的容器中的斑块支承部分的测量,以及病变的横截面面积和内腔在样品中选择的站点。大(主动脉),中型(股骨,颈动脉,锁骨下)小鼠动脉 – 那些通常用于对动脉粥样硬化和neotintimal损伤形成在小鼠中分析 – 是成功使用该方法进行分析。事实上,我们现在已经使用OPT证明药物干预和遗传操作对动脉粥样硬化和内膜病灶大小的影响。例如,内皮素受体 阻断改变内膜病变的形成而从血管内皮选择删除的内皮素B受体的没有15。在动脉粥样硬化易感小鼠,基因缺失的酶的11β-HSD1 16或半乳凝素3 17被示出,以减少粥样硬化病变的大小。
病灶体积的定量OPT是一个明显的好处。它给出的总损伤负担在动脉4更翔实的指示比通常用组织学方法获得。整个分析病变减少选择偏差和错误,当船只分立部分被选择的分析将不可避免地发生。生产纵向病变型材是OPT的进一步强度通过诱导不同类型的损伤13,16( 图5)病变的比较强调。例如,既要完成结扎线插入诱导几乎完全闭塞接近femero腘分叉。线损伤,但是,产生了病变沿扫描部的整个长度上延伸,而引起的动脉结扎病变迅速减小尺寸和消失。这个模式是具有较大程度的伤害所造成的插入血管成形术导丝的相一致。生成使用组织切片类似的结果是昂贵的,耗时的和劳动密集的。
OPT的优点包括它产生的图像的质量和它的相对速度和简单(我们已经常规扫描每天20血管)。图像质量出现优越或至少相当,以其他方法,用于产生三维图像的离体 (如MRI和微CT)中,yOPT等需要(我们的研究是典型的1-2sec /形象整合时间)并且是更便宜更短的扫描时间。样品制备延伸到数天,但只需要很少的劳动力,船舶可以分批编制和数据可以在一个会议上获得的。因此,吞吐量高,并且不需要延长扫描器的使用。重要的是,OPT的非破坏性的性质意味着它可以被用来确定用于免疫组化检查感兴趣的地点;从而减少切削的量和染色必需的。这是可能的高分辨率超声发展将为病变动脉这种大小的体积定量的另一种方法,但作者没有察觉到,证明本申请的任何出版物。
也许并不奇怪,在OPT图像质量劣于显微技术(可,当然,只能在较小的样品进行)。建议细化到重构n个数据的可能解决此限制,允许图像质量19,20的未来改进。另一种方法值得关注的是组织处理改变了样品的特性。例如,清除剂的亲脂性,苄醇/苯甲酸苄酯(BABB),很可能是由动脉粥样硬化病变除去脂质,而现有脱水可能会引起收缩率(当然,虽然,脱水和脂质去除步骤也的特征在石蜡包埋的样品制备)。 BABB用于本调查如,在具有亲水结算剂比较( 例如甘油21)它会导致在形态只有小的变化。
有几种可能性为OPT的进一步发展和完善,特别是关于跟踪关键细胞的3维排列和信令参与动脉重构的因素。动脉组织的强的自体荧光,这是这样一种Ñ 优点在解剖图像的产生,不受漂白22的现有的方法猝灭并且可以限制使用荧光探针来评估RNA和蛋白质分布模式。使用比色探针( 例如 β半乳糖苷酶)通过透射成像可视化可以克服这种限制。
最后,OPT具有病变的动脉小鼠的内膜的三维成像的巨大潜力。它代表了2维的方法通常是劳动密集型的,不能有效地代表总病灶体积相当大的进步。 OPT是比较快的,方便和非破坏性的。在图像分析的新发展的承诺,以进一步提高该技术的功率和效用。
The authors have nothing to disclose.
(;亨利Dryerre方案LL)和资金由英国心脏基金会(PWFH,BRW,DJW,这项工作是由爱丁堡大学(NSK)和卡内基信托studentships支持RG / 05/008,PG / 05/007; PG / 08/068/25461)和威康信托基金会(JRS,BRW,DJW; 08314 / Z / 07 / Z)。作者感谢为到中心心血管科学所提供的BHF-资助优秀成果奖中心支持他们的工作。
作者是在建立内膜病变生产的手术模型的意见正隆SATA(德岛大学)和伊戈尔Chersehnev博士(在Ernane李嘉欣博士群在医学西奈山医学院)教授特别感谢。视频制作和萨塔等提供。(http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm)是特别有用的。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Operating Microscope | Zeiss, Germany | N/A | OPMI Pico i |
Anaesthetic Machine | Vet Tech, UK | N/A | |
Fluovac | Harvard Apparatus UK | 340387 | |
Fluosorber | Harvard Apparatus UK | 340415 | |
Bead Steriliser | Fine Science Tools, UK | 1800-45 | |
Heated Mat | Fine Sceince Tools, UK | 21061-10 | |
Balance | Mettler Toledo | MS1602S | PB1502 or equivalent |
Sutures | Ethicon, UK | 5/0 Mersilk | |
Guidewire | Cook Inc, USA | C-PMS-251 | 0.014” |
Suture Silk | Fine Science Tools, UK | 18020-60 | 6/0 Mersilk |
Surgical Tools | Fine Science Tools, UK | 14058-09 | Toughcut Iris scissors |
15000-01 | Cohan-Vannas Spring Scissors | ||
11251-35 | Dumont #5/45 Forceps | ||
11370-31 | Moria Iris Forceps | ||
13008-12 | Halsted-Mosquito Haemostat | ||
18050-35 | Bulldog clips | ||
Bioptonics 3001 Tomograph | Bioptonics, UK | N/A | |
Magnetic OPT Mount | Bioptonics, UK | N/A | |
Computer | Dell Inc, UK | N/A | |
Peristaltic pump | Gilson | F117606 | Minipuls 3 |
DataViewer software | Skyscan, Belgium | v.1.4.4 | |
NRecon software | Skyscan, Belgium | v.1.6.8 | |
CTan software | Skyscan, Belgium | v.1.12 | |
Isoflurane | Merial Animal Health Ltd, UK | AP/Drugs/220/96 | 100% Inhalation vapour, liquid |
Medical Oxygen | BOC Medical, UK | UN1072 | |
Vetergesic | Alstoe Animal Health Ltd, UK | N/A | 0.3mg/ml |
1% Lignocaine | Hamlen Pharmaceuticals, UK | LD1010 | 10ml ampoule |
EMLA Cream | Astra Zeneca, UK | N/A | |
Sodium Pentobarbital | Ceva Animal Health Ltd, UK | N/A | |
Western Diet | Research Diets, USA | D12079B | 0.2% cholesterol |
Phosphate Buffered Saline | Sigma UK | P4417 | |
Heparin (Mucous) | Leo Laboratories, UK | PL0043/003GR | 25, 0000 Units |
Neutral Buffered Formalin | Sigma, UK | HT501128 | 10% |
Ethanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20821.33 | Absolute AnalaR |
Agarose | Invitrogen, UK | 16020050 | Low melting point |
Filter Paper | GE Healthcare, UK | 113v | Whatman |
Cyanoacrylate adhesive | Henkel, UK | 4304 | Loctite |
Benzyl alcohol | Sigma, UK | B6630 | |
Benzyl benzoate | Sigma, UK | 402834 | |
Methanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20856.296 | 100% |