JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Генерация и 3-мерная Количественное поражений артерий у мышей, используя оптической проекционной томографии

Published: May 26, 2015
doi:
10.3791/50627
, , , , , , ,
1University/ BHF Centre for Cardiovascular Science, University of Edinburgh,The Queen’s Medical Research Institute

Summary

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Abstract

Генерация и анализ сосудистых поражений в соответствующих моделях животных является краеугольным камнем исследований в сердечно-сосудистых заболеваний, создавая важную информацию о патогенезе формирования поражения и действия новых методов лечения. Использование атеросклероза подверженных мышей, хирургических методов индукции поражения, и диетических изменений значительно улучшилось понимание механизмов, которые способствуют развитию болезни и потенциал новых методов лечения.

Классически, анализ поражений выполняется экс виво с помощью 2-мерных гистологические методы. Эта статья описывает применение оптической проекционной томографии (OPT) в 3-мерном количественного артериальных поражений. В этот метод является неразрушающим, он может быть использован в качестве дополнения к стандартным гистологических и иммуногистохимических анализов.

Неоинтимальная поражения были вызваны проволоки вставки или перевязки бедренной мыши искусстваERy время атеросклеротических поражений были получены путем введения атерогенной диете в ароЕ-дефицитных мышей.

Поражения были изучены с помощью OPT изображений эмиссии autofluorescent затем дополнительного гистологического и иммуногистохимического анализа. OPT четко отличать поражения от основной сосудистой стенки. Размер повреждения была рассчитана в 2-мерных сечений с помощью планиметрии, что позволяет рассчитать объем поражения и максимальной площадью поперечного сечения. Данные, полученные с помощью OPT согласуются с измерениями, полученными с использованием гистологии, подтверждающие достоверность методики и ее потенциал в качестве дополнения (а не альтернативы) к традиционным методам анализа.

Эта работа демонстрирует потенциал ОПТ для визуализации атеросклеротических поражений и неоинтимальная. Это обеспечивает быстрый, столь необходимую экс естественных условиях технику для обычного 3-мерного количественного сосудистого ремоделирования.

Introduction

Формирование артериальных поражений центральной высокой заболеваемости и смертности, связанной с сердечно-сосудистыми заболеваниями 1. Образование Поражение считается быть вызвано неограниченной воспалительной реакции с повреждением артерии 2. Атеросклеротических поражений образуют медленно в ответ на хроническим повреждением к артериальной стенки, тогда как restenotic повреждения развиваются быстро после острого механического повреждения (например, после имплантации стента). Механизмы, которые способствуют развитию артериальных повреждений были существенно уточнены с использованием соответствующих моделей животных, часто в сочетании с соответствующими генетических манипуляций 1.

Анализ размера повреждения и состава классически значительной степени зависит от естественных экс, 2-мерном гистологии (хотя эта ситуация меняется с развитием более совершенных методов для в естественных условиях и экс естественных условиях обнаружения и анализа повреждений в небольших животных <SUP> 3). Гистологический анализ артериальных поражений является трудоемким, отнимает много времени и обеспечивает ограниченную информацию о 3-мерной структуре. Например, нагрузка поражения обычно оценивали путем измерения площади поперечного сечения поражения (либо в случайно выбранных местах или в месте максимальной окклюзии). Это обеспечивает неполную анализ общего бремени поражения. Всего монтажа 3-мерного изображения технология обеспечивает возможное решение этой проблемы, но на удивление мало подходящие подходы были описаны. Это может быть связано преимущественно с размером артерий мыши, которые являются слишком большими для однофотонной конфокальной микроскопии, но слишком мал для магнитно-резонансной томографии (МРТ) 4 и рентгеновской компьютерной томографии (КТ) 5. Применение экс естественных условиях МРТ и КТ микро к изучению атеросклеротических поражений у мышей предполагает, что они предлагают ограниченное разрешение, даже в относительно крупных артерий. В дополнение к этому, требуется сравнительно длительное время приобретенияограничить пропускную (и увеличить расходы сканирования) 4,6.

Разработка новых методов оптической визуализации (например, оптической когерентной томографии 3,7 и фото-акустической томографии 8) предлагает большой потенциал для улучшения визуализации поражений в мышиных артериях. Аналогичная потенциал показано оптической проекционной томографии (OPT), которая была разработана, чтобы позволить анализ эмбрионов мыши. ОПТ был разработан, чтобы образцов изображений, начиная от ~ 0.3-10 мм в диаметре 9. Передача изображений регистрирует непрозрачность полупрозрачного образца полихроматического видимого света и, могут быть использованы для идентификации анатомических структур. Излучение записи изображений излучение света при возбуждении на конкретных длин волн от эндогенных (например, коллагена, эластина) и экзогенных флуорофоров в образце. Это может также обеспечить анатомическую информацию (так как различные компоненты ткани могут отличаться по типу и плотности autofluorescent видовнастоящее время). Кроме того, распределение иммунореактивности или экспрессии гена может быть определена с использованием соответствующих флуоресцентных зондов 10. Для любой режим изображения (передачи или излучения), свет фокусируется на прибор с зарядовой связью, чтобы итерационный захват изображения в качестве образца вращается (обычно 400 изображений в 0,9 ° с шагом). Они могут быть использованы для расчета объема с помощью стандартных методов реконструкции томографических (например, отфильтрованной задней проекции (с использованием алгоритма конус) или итеративного реконструкции).

Это видео демонстрирует нашу новую заявку на ОПТ для быстрого, количественно и экономически эффективным 3-мерного анализа атеросклеротических поражений и неоинтимы, как описано ранее в Киркби др. 11. Техника была показана, чтобы быть пригодным для количественного размера поражения в трех наиболее часто используемых моделей: (I) бедренной артерии провод-травмы; (II) бедренной артерии лигирование, и (III) диеты, вызванной атеросклерозом, в apolipoproteiП Е дефицит (ароЕ – / -) мышей.

Protocol

1. Хирургическое Индукция неоинтимальная поражений в артерии мыши бедренной Эксперименты с использованием животных должны быть выполнены в соответствии с требованиями национальных и институциональных этики. Все операции должны быть выполнены с использованием соответствующего асептики. Индукция неоинтимы поражений достигается с использованием модификации метода, описанного Роке и др. 12 и Sata соавт. 13. Взвесьте мужской C57BL6 / J мышей (возраст 10-12 недель, вес 25-30 г), то обезболивания путем предоставления 4-5% изофлуран в индукции камеры. После анестезии был вызван, передавать мышь к нагретой коврик для поддержания температуры тела при 37 ° С. Продолжить введение изофлуран (2-3%) с помощью маски. После того, как соответствующий уровень анестезии был вызван (отсутствие реакции на носок щепотку), обеспечивают обезболивающий крышку администрацией бупренорфина (0,1 мг / кг -1). Затем поместите курсор в лежачем положении апD брить вентральной поверхности левого задних конечностей. Сделайте надрез, чтобы разоблачить мышцы верхней задней конечности и, между бифуркации с подколенной артерии и передней брюшной стенки, используйте тупым, чтобы изолировать бедренную артерию и вену от бедренного нерва. Промывать рану при необходимости с использованием 1% вес / объем лидокаина. Поместите проксимальную (близко к передней брюшной стенки) и дистальной (сразу под ветви с подколенной артерии) временные лигатуры (6/0) Mersilk вокруг бедренной артерии и вены, чтобы контролировать кровоток. Затем изолировать подколенную артерию (для 2-5 примерно мм дистальнее филиала с бедренной артерии) и перевязывать дистальнее. Поместите второй, развязал лигатуры под подколенной артерии. Сделать небольшой надрез (артериотомия) в подколенной артерии, непосредственно дистальный к ветви с бедренной артерии, предотвращая кровотечение, применяя давление к проксимальному временной лигатуры. Авансовые прямо, возникли 0,014 "проводник1-1,5 см вдоль бедренной артерии в направлении брюшной стенки и оставить на месте в течение 30 сек (фиг.1А). Снимите проволочный и перевязывать подколенной артерии выше артериотомии, используя лигатуры размещены для этой цели, и заботиться, чтобы не закупоривать бедренную артерию. ПРИМЕЧАНИЕ: Для лигирования поражении. Неоинтимы ремоделирование без внутрипросветного травмы могут быть вызваны путем лигирования бедренной или подколенных артерий (фиг.1В и 1C). Для достижения этой цели выполните шаги 1.1-1.5. Тем не менее, не делают, но артериотомии (избегая шаг 1.6) либо (I) перевязывать подколенной артерии сразу дистальнее бедренной артерии или (II) лигировать общей бедренной артерии в точке ветвления с подколенной артерии. Затем переходите к шагу 1.8. Удалить временные лигатуры, закрыть рану с разрывной внешнего шва (5/0 Mersilk) и применять крем EMLA (2,5% лидокаин, 2,5% прилокаин). Дают животным повторно получить сознание (как правило, 5-10 мин) и убедиться, что они двигаются свободно вокруг своей клетке (небольшое хромота может быть очевидным в пораженной ноге, но это должно решить в течение первых 2-3 дней после операции), прежде чем вернуться к проведению номера. Мыши не должны быть размещены по отдельности после операции. Разрешить животных для восстановления на срок до 3 месяцев. Небольшие повреждения начнут появляться ~ 7 дней после травмы проволоки и достигнет стабильного максимальный размер после ~ 21-28 дней. 2. Индукционная атеросклеротических поражений в аполипопротеина Е – / – Мыши Администрирование западную диету (0,2% холестерина, исследования диеты, США) мужчина, в возрасте 6 недель АроЕ-нулевых мышей (разводят в доме) в течение 12 недель. Атеросклеротические поражения часто видны на валовой инспекции дуги аорты и ее главных ветвей (рис 2). 3. Анализ поражения артерий с помощью оптической проекционной томографии (ОПТ) нт "> Примечание: OPT изображения поражений в мышиных бедренных артерий и аорты образцов арки были получены с использованием оптического проецирования томограф. Эвтаназии мышей transcardiac перфузии фиксации и обескровливание под анестезией терминала (80 мг / кг пентобарбитала натрия), использованием гепаринизированной (10 ед / мл) забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), а затем 10% -ный нейтральный забуференный формалин. Изолировать бедренных артерий или дуги аорты и ее крупных ветвей (левой сонной артерии, левой подключичной артерии, брахиоцефальных ствол), по мере необходимости, и удалить лишние пери-адвентициальные материал. После исправления в 10% буферном растворе формалина O / N, перед хранением в 70% этанола, пока не понадобится. Встраивание артерии в 1,5% легкоплавкой агарозы, предварительно фильтруют через Whatman 113 V бумаги. Прикрепите каждый образец магнитного ОПТ крепление с цианакрилатного клея с осью сосуда в соответствии с тем, что на горе. Обрежьте излишки агарозы с конической формы. Дегидрировать в 100% метанола, по крайней мере 12 часов. СLear сосуды погружением (12-24 ч) в смеси бензилового спирта и бензилбензоата (1: 2 об / об). Поместите очищенные образцы калиброванного томографа. Установите разрешение в 1024 х 1024, и определить оптическое увеличение, что позволяет всей площади интереса не было видно. ОПТ объем изотропно г-ось реконструирован в той же резолюции (то есть, 1024 х 1024 х 1024), размер воксел ~ 200 мкм. Это может представлять собой по-оценку резолюции есть, вероятно, будет артефакты реконструкции. Регулировка положения образца, так что она вращается на своей оси в центре поля зрения в светлом поле, канала передачи. В канале эмиссии GFP1 фильтра (фильтр возбуждения 425 нм с 40 нм полосовой; фильтра выбросов: 475 нм длинный пас), сосредоточиться образца и корректировать время экспозиции, чтобы максимизировать динамический диапазон полученного изображения (избегать чрезмерной насыщенности). Сканирование сосуда только в канале излучения GFP1, с шагом 0,9 ° вращения. </ LI> По завершении, подтвердите качество сбора данных с использованием программного обеспечения DataViewer. Удалить образец из сканера. Чтобы последующее гистологический анализ, место образца в 100% метанола для> 24 часов, прежде чем обработка в парафин воск, как обычно. 4. Изображение Реконструкция и анализ Томографической повторно строительство фильтрацией обратного проецирования осуществляется с помощью программного обеспечения NRecon или аналогичный. Реконструкция может быть выполнена без присмотра, в партиях. Улучшение качества изображения, компенсируя смещение и регулировка уровня яркости изображения. Проверьте качество восстановления изображения с помощью программного обеспечения DataViewer. Определить соответствующий раздел образца для анализа. Держите эту длину последовательной между судами, если просвета размеры должны быть записаны. Определить план поражений вручную отслеживания соответствующий границу для 1 на каждые 50 реконструировано сечений, Проверьте каждый перемеженные поперечное сечение, чтобы обеспечить машинно-генерируемые интерполяции являются правильными. Ручная регулировка границу, где это необходимо. Установите порог серо-уровня, так что выбирается только поражение и экспортировать данные измерений. Для каждого сканирования, определить вертикальную область интереса, содержащего повреждение и проследить границу между средствами массовой информации и неоинтимы (т.е.., Положение внутренней упругой пластинки) для каждого 50-й линии сканирования. Интерполировать интима / медиа границы для вкладных строк развертки в программном обеспечении, и проверять и корректировать посадку, где требуется. Кроме того сегмент этого определяется трехмерную объем порога вручную определенной интенсивности, чтобы произвести двоичный набор изображения, в котором белые пиксели представляют неоинтима и черные пиксели представляют патентные просвет. Измерения, проведенные включают в себя: общий объем поражения (объем объекта), просвета объем (общий объем – объем объекта) и распределение поражения и просвет поперечного сектыРациональная зона вдоль осевой длины исследуемого судна.

Representative Results

Предварительное сканирование здоровых (непораженный) мышиных бедренных артерий (п = 5) показали, что визуализация передачи не обеспечивают полезные изображения. Это было следствием очищенных артерий становятся слишком прозрачным (а не слишком непрозрачный) для передачи imaging.However, это полезно для визуализации выбросов, нет поглощения / рассеяние излучаемого сигнала. В противоположность этому, бедренные артерии autofluoresce сильно в канале излучения, с наибольшей сигнала при возбуждении на 405-445 нм (в соответствии с пиком возбуждения 410 нм для эластина 14). 2-мерных ломтики реконструированные из этих образов четко отличать СМИ из просвета и адвентиции и просвета. В мышиных бедренных артерий собирают 28 дней после проволочных (N = 6) или ligation- (N = 5), индуцированное повреждение неоинтимальная утолщение было очевидным в не-томографических проекций выбросов (рис 3а). В реконструированных 2-РАЗМЕРЫломтики Рациональная концентрические неоинтимы поражений можно выделить из среды их слабого излучения (рис 3B и фиг S1). Эмиссионные изображения ОПТ целых образцов монтирования дуги аорты и ее основные ветви от атеросклеротических мышей (п = 8), выявленные поражения с ожидаемым анатомической распределения (т.е.., В меньшей кривизны дуги аорты, брахиоцефальных артерий и происхождении левой сонной артерии и левой подключичной артерий (рис 4а). Поперечные изображения показали, что это были обычно эксцентричные поражения и были легко отличить от средств массовой информации и просвета (4В, рис S2 и S3). Обработка артерии для гистологического анализа следующей ОПТ подтвердил неразрушающий характер ОПТ, с разделами успешно окрашенных с помощью гистологического (США Trichrome, Picrosirius красный) и иммуногистохимическое (α-SMA, Мак-2) методы (рис 3C и 4C). Измерение размера повреждений с использованием OPT было показано, что в соответствии с результатами измерений, полученных с помощью анализа изображений гистологических срезов, взятых из той же артерии 11. Контурные измерения площади зоны поражения, полученные ОПТ и гистологии тесно коррелируют с помощью линейной регрессии для проволочных (R 2 = 0,92) и лигирования-индуцированной (R 2 = 0,89) неоинтимы поражений и атеросклеротических бляшек (R 2 = 0,85). Важным преимуществом ОПТ является его способность для того, чтобы 3-мерное анализ. Развивая объемный количественного поражений с этой техникой, мы смогли записать объемы поражения в проволочных (0,1100 ± 0,0091 мм 3; п = 6) и лигирования ранения бедренные артерии (0,0200 ± 0,0089 мм 3; п = 5), а также в атеросклеротических брахиоцефальных артерий (0.180 ± 0,018 мм 3; N = 8). Измерения были высоко воспроизводимыми (коэффициенты вариации 5,4%, 11,4% и 4,8%, соответственно, п = 4) для всех типов поражений. Неоинтимальная поражения в проводных ранения сосудов были больше (р <0,0001), чем те, производится перевязка, в соответствии с большей степенью ущерба, нанесенного прежним. Данные, полученные также может быть выражена как поражения профилей (рисунок 5) и вынесли для динамического, качественной оценки (см рисунки S1 – S3). Этот подход наглядно продемонстрировал степень формирования поражения в ответ на различные процедуры травмы, и подчеркнул неравномерное распределение формирования поражения в пострадавших судов. Рисунок 1: Методы для инициирования образования поражения в мышиной бедренной артерии и #.160; (А) ретроградный вставка ангиопластики проволочный направитель в бедренную артерию, с помощью артериотомии в подколенной артерии стимулирует образование поражения в ответ на травму растянуть и удаление эндотелия. Кровоток восстанавливается по травмированной части судна. (Б) неоинтимы пролиферацию в отсутствии внутрипросветного растяжения, денудации или прерывания потока крови может быть вызван либо путем лигирования бедренной или подколенной артерии сразу дистальнее бифуркации бедренной артерии. (С) более серьезными, не уничтожив ответ травмы / распространение может быть вызвано лигирования обе бедренные артерии и подколенных по точке ветвления общей бедренной артерии. Эта техника будет также блокировать поток крови в дистальной части бедренной артерии. Рисунок 2:. Характеристика осаждение атеромы в дуге аорты мыши Атеросклероз склонны (Apolipopotein Е дефицитных мышей) кормили высокий уровень холестерина западный рацион в течение 12 недель развивают характерную картину осаждения поражения в дуге аорты и ее основных ветвей. Как показано, поражения видны (стрелки), по грубой осмотра под микроскопом рассекает, в дуге аорты, брахиоцефальных артерий, и в устьев левой сонной артерии и левой подключичной артерии. Рисунок 3:. Формирование поражений следующие перевязки левой бедренной артерии (A) Номера томографические изображения флуоресценции (перевернутые увеличить ясность – темные области соответствуют более сильной эмиссии) позволяют идентифицировать утолщением интимы (красный arrowheобъявления). (Б) Различные сосудистые регионы и просвет можно выделить томографических реконструкций. (С) Гистологический анализ (США трихромом) подчеркивает четкое сходство с изображениями, полученными с использованием OPT. Масштабные бары в (AC) 200 мм. Взято из Керкби др. 11 масштабной линейки в (AC) 200 мкм. Рисунок 4:. Изображений атеромы в дуге аорты атеросклероза подверженных мышей (А) атеромы (красные стрелки) является очевидным в не-томографических изображений (перевернутой, так что темные области указывают сильнее излучение, улучшая таким образом четкость) дуги аорты, в местах предсказано атеромы-подшипника осмотром при световой микроскопии (рис 2). (B) Этот рисунок распределения подтверждается в томографической крOSS-секции. (С) Гистологическое (США трихромом) окрашивание показывает близкое сходство с томографических сечений и иммуногистохимии с использованием нескольких различных антител подчеркивает взаимодополняющий характер ОПТ с традиционными подходами к анализу повреждений. Масштабные бары в (A-B), являются 1 мм; Бар Шкала в (С) составляет 250 мкм. RSA, правой подключичной артерии; RCA, правую сонную артерию; ДМС, левую сонную артерию; НУА, левой подключичной артерии; ДСС, брахиоцефальных артерий; ААО, восходящей аортой; Дао, нисходящей аорты. Взято из Керкби др. 11 Рисунок 5: Анализ поражения и просвет профилей указывает различной степени пролиферации неоинтимы в ответ на различные методы артериальным повреждением оптической проекционной томографии позволяет поражение и просвета в разрезе, проводились измерения.TS быть заговор против расстояние вдоль бедренной артерии. Это ясно показывает, что, по сравнению с неповрежденной артерии (А), частичного лигирования (B) производит небольшие, относительно дискретных поражений, в то время как общая лигирование (С) производит полный окклюзии в участке лигирования, но поражение не распространяется далеко вдоль артерии , Внутрипросветного провод травмы (D) производит поражение, которое почти полностью закрывает дистальный участок образца и проходит по всей длине сканируемого участка артерии. Взято из Керкби др. 11 Рисунок S1. Анимированные реконструкция изображения поперечного сечения, полученных из мыши бедренной артерии после травмы перевязки. Этот тип анимационного изображения полезно как для качественного и количественного анализа. Как анимация движется от проксимального к дистальных отделов артерии постепенное развитие окклюзионной неоинтиме, дискernible из просвета и средств массовой информации, является очевидным. Боковые ветви могут быть легко идентифицированы и существует очевидна просвета окклюзии и наружу ремоделирование артерии как поражения увеличивается в размерах. Полной окклюзии сосуда происходит один раз сайт лигирования достигается. Взято из Керкби др. 11 .. Рис S2 Анимированные реконструкция изображения поперечного сечения из дуги аорты от атеросклероза подверженных мыши анимация начинается с сечений восходящих (слева – что появляется первым) и нисходящей (правой) аорты. Небольшие поражения появляются в восходящей аорте в качестве сканирования перемещается в направлении дуги аорты. Изображения затем перейти через арку, чтобы показать значительной степени пораженное Остии брахиоцефальных (слева), левой сонной (средний) и левой подключичной (справа) артерий. Как сканирования перемещается дистально вдоль этих ветвей поражения постепенно уменьшить и исчезают, сначала в subclavian артерии, то в сонной артерии и, наконец, в брахиоцефальных артерий. Интересно, что поражение в движении брахиоцефальных артерий на делитель потока, как этого судна делится на правой сонной артерии и правой подключичной артерии. Взято из Керкби др. 11 Рисунок S3. Анимированные объем-изображение из дуги аорты от атеросклероза подверженных мыши. Оптической проекционной томографии позволяет генерировать 3-мерных изображений, в данном случае демонстрирует распределение поражения в дуге аорты на аполипопротеина E дефицитных мышей. (А) Атеромы присутствует в ожидаемых сайтов (по всей брахиоцефальных артерий, в устьев в левую сонную и подключичной артерии и в меньшей кривизны дуги аорты). (Б) Сегментация и предоставление поражения (показан красным) подшипника сечения подчеркивает распределение бляшек при наложении на исходном изображении.Взято из Керкби др. 11

Discussion

3-мерное анализ имеет большой потенциал для замены или добавления к 2-мерных гистологических методов, которые по-прежнему лежат в основе большинства исследований формирования артериальной поражения. Здесь OPT показано в небольших мышиных артерий (с мышиных бедренных артерий, вероятно, представляющих мельчайших сосудов, которые могут быть проанализированы успешно используют эту технику). Это, однако, также пригодны для использования с артерий (и поражений) от других видов, в том числе малых и средних размеров человека сосудов; наша группа успешно использовала технику, чтобы проанализировать поражений в аорте кролика (Безуиденхоут др;. не опубликовано). OPT обещает более быстрое анализ и повышенную структурную информацию по сравнению с традиционной гистологии и имеет то преимущество, не предотвратить дальнейший анализ образца с использованием гистологических и иммуногистохимических и методы.

Изображения, полученные с использованием OPT дал анатомическое деталь, с указанием местонахождения формирования пораженияи размер повреждений в этих областях. Артерии, используемые в этих исследованиях, вероятно, близки к пределу разрешения для техники и качества изображения, поэтому нарушение в определенной степени от артефактов (вероятно, в результате вращения смещения, неполной очистки, отражения / преломления в агарозном вершин и проблемы фокусировки) , Несмотря на это, детали, необходимые (т.е. слои стенки сосуда) остается заметной и, следовательно, этот метод является чрезвычайно полезным для количественного определения отдельных слоев. В самом деле, изображения могут быть быстро и воспроизводимо количественно, чтобы обеспечить измерения поражения и объема просвета в бл подшипников секций судна, а также кросс-секционные области поражения и просвет на отдельных участках в образце. Большой (аорта) и средних (бедренная, сонной, подключичной) мышиные артерии – те, которые обычно используются для анализа атеросклеротического и neotintimal формирования поражения у мышей – были успешноанализировали с помощью этого метода. Действительно, мы в настоящее время используется OPT, чтобы продемонстрировать эффект фармакологических вмешательств и манипуляций с генами на атеросклеротической и неоинтимальной размера повреждения. Например, блокада рецепторов эндотелина изменены образование неоинтимы поражения, тогда как селективный удаление рецептора эндотелина B из сосудистого эндотелия не так 15. При атеросклерозе, склонной мышей, генетическими исключение из ферментов 11β-HSD1 16 или 17 галектин 3 было показано, чтобы уменьшить размер атеросклеротических поражений.

Количественное объема поражения является очевидным преимуществом ОПТ. Это дает более информативный признак общего бремени поражения в артерии 4, чем обычно, полученной с гистологических методов. Анализируя весь поражение уменьшает смещение отбора и ошибки, которые неизбежно будут возникать при дискретных разделы судна выбраны для анализа. Производство продольных профилей поражение дополнительно прочность OPT, Подчеркивается сравнению поражений, вызванных различными видами травм 13,16 (рисунок 5). Например, как полная лигирование и провод-вставки индуцированной почти полную окклюзию близко к femero-подколенного бифуркации. Травмы провода, однако, полученные поражения, что расширенные по всей длине сканируемого участка, тогда как повреждений, вызываемых артериальным лигирования быстро уменьшается в размере и исчезает. Эта модель согласуется с большей степени повреждений, вызванных введением ангиопластики проводника. Создание подобных результатов с помощью гистологических дорого, отнимает много времени и трудоемким.

Преимущества OPT включают качество изображений производит и его относительную скорость и простоту (мы обычно сканируются 20 судов в сутки). Качество изображения появляется превосходит, по крайней мере, сопоставимы, с другими методами для генерации 3-мерных изображений экс виво (например, MRI и микро- КТ), уи др ОПТ требуется меньше времени сканирования (время интеграции для наших исследований было, как правило, 1-2sec / изображения) и дешевле. Подготовка образца на протяжении нескольких дней, но требуется немного труда, сосуды, могут быть получены в партиях, и данные могут быть получены в одной сессии. Следовательно, пропускная способность высока, и не требует длительного использования сканера. Важно отметить, что неразрушающий характер OPT означает, что могут быть использованы для идентификации сайтов, представляющих интерес для иммуногистохимического исследования; Таким образом, уменьшая количество резки и окрашивания требуется. Вполне возможно, что развитие высоких ультразвука разрешением обеспечит альтернативный способ объемного количественного поражений артерий в этот размер, но авторы не знают о каких-либо публикаций, которые демонстрируют это приложение.

Неудивительно, что качество изображения на ОПТ уступает микроскопических методов (которые могут, конечно, быть выполнены только на небольших образцов). Предлагаемые уточнения к reconstructioн данных может решить эту ограничение, позволяя в будущем улучшение качества изображения 19,20. Другой методологический беспокоит то, что обработка ткани изменяет характеристики образца. Например липофильный характер Осветлитель, бензиловый спирт / бензилбензоат (Babb), вероятно, чтобы удалить липидов из атеросклеротических поражений, в то время как до обезвоживание может привести к усадке (хотя, конечно, обезвоживание и удаление липидов шаги также особенность подготовка образцов для встраивания в парафин). Babb был использован в данном исследовании в качестве, по сравнению с гидрофильными клиринговых агентов (например, глицерин 21) это вызывает лишь небольшие изменения в морфологии.

Есть несколько возможностей для дальнейшего развития и совершенствования ОПТ, особенно в отношении отслеживания 3-пространственное расположение основных элементов и факторов, участвующих в артериальной реконструкции сигнализации. Сильный флуоресценции артериальной ткани, которая является такимп преимуществом в генерации анатомические изображения, не гасили существующих методов отбеливания 22 и может ограничивать использование флуоресцентных зондов для оценки РНК и белка распределения модели. Использование колориметрических датчиков (например, β-галактозидазы) визуализировали с помощью визуализации передачи может преодолеть это ограничение.

В заключение, ОПТ имеет большой потенциал для 3-мерного изображения поражений в интиме артерий мышиных. Она представляет собой значительный шаг вперед на 2-мерных методов, которые, как правило, трудоемкий и не эффективно представляют общий объем поражения. ОПТ сравнительно быстро, удобно и неразрушающего. Новые разработки в области анализа изображений обещают дальнейшее увеличение мощности и полезность этого метода.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана studentships из Университета Эдинбурга (NSK) и Карнеги Trust (LL; Генри схемы Dryerre) и финансирования из Британского фонда сердца (PWFH, BRW, DJW; RG / 05/008; PG / 05/007; PG / 08/068/25461) и Wellcome Trust (JRS, BRW, DJW; 08314 / Z / 07 / Z). Авторы благодарны поддержка их работы, предоставленной BHF финансируемого Центром исследований Excellence Award в Центр сердечно-сосудистой науки.

Авторы особенно признательны за советом от профессора Масатака Sata (Университет Токусима) и д-р Игорь Chersehnev (в группе д-ра Ernane Рейс "на горе Синайской школы медицины) о создании хирургических моделей производства неоинтимальная поражения. Видео производится и продается Sata и др. (Http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) было особенно полезным.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Operating Microscope Zeiss, Germany N/A OPMI Pico i
Anaesthetic Machine Vet Tech, UK N/A
Fluovac Harvard Apparatus UK 340387
Fluosorber Harvard Apparatus UK 340415
Bead Steriliser Fine Science Tools, UK 1800-45
Heated Mat Fine Sceince Tools, UK 21061-10
Balance Mettler Toledo MS1602S PB1502 or equivalent
Sutures Ethicon, UK 5/0 Mersilk
Guidewire Cook Inc, USA C-PMS-251 0.014”
Suture Silk Fine Science Tools, UK 18020-60 6/0 Mersilk
Surgical Tools Fine Science Tools, UK 14058-09 Toughcut Iris scissors
15000-01 Cohan-Vannas Spring Scissors
11251-35 Dumont #5/45 Forceps
11370-31 Moria Iris Forceps
13008-12 Halsted-Mosquito Haemostat
18050-35 Bulldog clips
Bioptonics 3001 Tomograph  Bioptonics, UK N/A
Magnetic OPT Mount Bioptonics, UK N/A
Computer Dell Inc, UK N/A
Peristaltic pump Gilson F117606 Minipuls 3
DataViewer software  Skyscan, Belgium v.1.4.4
NRecon software  Skyscan, Belgium v.1.6.8
CTan software Skyscan, Belgium v.1.12
Isoflurane Merial Animal Health Ltd, UK AP/Drugs/220/96 100% Inhalation vapour, liquid
Medical Oxygen BOC Medical, UK UN1072
Vetergesic Alstoe Animal Health Ltd, UK N/A 0.3mg/ml
1% Lignocaine Hamlen Pharmaceuticals, UK LD1010 10ml ampoule
EMLA Cream Astra Zeneca, UK N/A
Sodium Pentobarbital Ceva Animal Health Ltd, UK N/A
Western Diet Research Diets, USA D12079B 0.2% cholesterol
Phosphate Buffered Saline Sigma UK P4417
Heparin (Mucous) Leo Laboratories, UK PL0043/003GR 25, 0000 Units
Neutral Buffered Formalin Sigma, UK HT501128 10%
Ethanol VWR BDH Prolabo, UK 20821.33 Absolute AnalaR 
Agarose Invitrogen, UK 16020050 Low melting point
Filter Paper GE Healthcare, UK 113v Whatman
Cyanoacrylate adhesive Henkel, UK 4304 Loctite
Benzyl alcohol Sigma, UK B6630
Benzyl benzoate Sigma, UK 402834
Methanol VWR BDH Prolabo, UK 20856.296 100%
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
  2. Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. N Engl J Med. 340, 115-126 (1999).
  3. Deuse, T. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J Vis Ex. (31), (2009).
  4. McAteer, M. A. Quantification and 3D reconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 2384-2390 (2004).
  5. Martinez, H. G. Microscopic Computed Tomography-Based Virtual Histology for Visualization and Morphometry of Atherosclerosis in Diabetic Apolipoprotein E Mutant Mice. Circulation. 120, 821-822 (2009).
  6. Langheinrich, A. C. Atherosclerotic Lesions at Micro CT: Feasibility for Analysis of Coronary Artery Wall in Autopsy Specimens. Radiology. 231, 675-681 (2004).
  7. Ambrosi, C. M. Virtual histology of the human heart using optical coherence tomography. J Biomed Opt. 14, 054002 (2009).
  8. Ku, G. Photoacoustic microscopy with 2-micron transverse resolution. J Biomed Opt. 15, 021302 (2010).
  9. Sharpe, J. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
  10. Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu Rev Biomed Eng. 6, 209-228 (2004).
  11. Kirkby, N. S. Quantitative 3-Dimensional Imaging of Murine Neointimal and Atherosclerotic Lesions by Optical Projection Tomography. PloS ONE. 6 (2), e16906 (2011).
  12. Roque, M. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid, accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 335-342 (2000).
  13. Sata, M. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32, 2097-2104 (2000).
  14. Richards-Kortum, R., Sevick-Muraca, E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis. Annu Rev Phys Chem. 47, 555-606 (1996).
  15. Kirkby, N. S. Non-endothelial cell endothelin-B receptors limit neointima formation following vascular injury. Cardiovascular Research. 95, 19-28 (2012).
  16. Kipari, T., et al. 11-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 deficiency in bone marrow-derived cells reduces atherosclerosis. FASEB J. 27 (4), 1519-1531 (2013).
  17. Mackinnon, A. C. Inhibition of galectin-3 reduces atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice. Glycobiology. 23 (6), 654-663 (2013).
  18. Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
  19. Walls, J. R. Correction of artefacts in optical projection tomography. Phys Med Biol. 50, 4645-4665 (2005).
  20. Walls, J. R. Resolution improvement in emission optical projection tomography. Phys Med Biol. 52, 2775-2790 (2007).
  21. Bucher, D. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100, 135-143 (2000).
  22. Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat Methods. 4, 31-33 (2007).

Tags

Optical Projection Tomography3D QuantitationArterial LesionsMiceAtherosclerosisNeointimal LesionsWire-insertionLigationApoE-deficientHistologyImmunohistochemistryVascular Remodeling

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Kirkby, N. S., Low, L., Wu, J., Miller, E., Seckl, J. R., Walker, B. R., Webb, D. J., Hadoke, P. W. F. Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography. J. Vis. Exp. (99), e50627, doi:10.3791/50627 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image