Summary

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Published: July 10, 2013
doi:

Summary

Se describe un protocolo para el aislamiento y purificación de los neutrófilos de médula ósea de ratón por centrifugación en gradiente de densidad y para el etiquetado de neutrófilos usando colorantes CellTracker. Esto representa un método sencillo, rápido, reproducible y económico para la obtención de un gran número de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo o experimentos de transferencia adoptivos y seguimiento.

Abstract

Los neutrófilos son las células efectoras críticas del sistema inmune innato. Ellos son reclutados rápidamente en sitios de inflamación aguda y ejercen efectos protectores o patógenos dependiendo del medio inflamatorio. No obstante, a pesar de la función indispensable de los neutrófilos en la inmunidad, la comprensión detallada de los factores moleculares que median efectos efectoras y inmunopatogénico neutrófilos 'en diferentes enfermedades infecciosas y condiciones inflamatorias que aún falta, en parte debido a su corta vida media, las dificultades con la manipulación de estos las células y la falta de protocolos experimentales fiables para la obtención de un número suficiente de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo y los experimentos de transferencia adoptiva. Por lo tanto, los métodos simples, rápidos, económicos y fiables son muy deseables para la recolección de un número suficiente de los neutrófilos de ratón para evaluar funciones como la fagocitosis, la matanza, la producción de citoquinas, degranulación y la trata. Para ese fin,se presenta un protocolo basado en centrifugación de gradiente de densidad reproducible, que se puede adaptar en cualquier laboratorio para aislar un gran número de neutrófilos desde la médula ósea de ratones con alta pureza y viabilidad. Por otra parte, se presenta un protocolo simple que utiliza colorantes CellTracker para etiquetar los neutrófilos aislados, que pueden entonces ser transferidos de manera adoptiva en ratones receptores y rastreados en varios tejidos durante al menos 4 horas después de la transferencia usando citometría de flujo. El uso de este enfoque, el etiquetado diferencial de los neutrófilos de ratones de tipo salvaje y deficiente en el gen con diferentes colorantes CellTracker se puede emplear con éxito para llevar a cabo estudios de repoblación competitivos para evaluar el papel directo de los genes específicos en el tráfico de los neutrófilos de la sangre a los tejidos diana in vivo .

Introduction

Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en los seres humanos. Ellos son el principal componente celular del sistema inmune innato y actúan como una primera línea de defensa contra los microorganismos invasores. Los pacientes con neutropenia adquirida y las inmunodeficiencias primarias que afectan el número de neutrófilos y / o la función de desarrollar infecciones bacterianas y fúngicas invasoras que amenazan la vida, destacando la importancia de estas células en la defensa de acogida 1. El reconocimiento inmune de patógenos invasores en el sitio de la infección por sus receptores de reconocimiento de patrones resultados análogos en la inducción de una respuesta inmune innata orquestada, lo que conduce a la secreción de factores quimiotácticos que generan un gradiente quimiotáctico capaz de reclutar neutrófilos de la circulación sanguínea en el tejido inflamado 2 . Después de neutrófilos entran en el sitio de la infección, que se activan, lo que conduce a la producción de citoquinas y quimioquinas, la absorción de patógeno, y matar a través de mí oxidativo y no oxidativocanismos 3. Además de su papel bien conocido en la inmunidad innata, los neutrófilos también se ha demostrado recientemente para desempeñar papeles importantes como iniciadores de la respuesta inmune adaptativa eficaces 4. Por otro lado, además de sus funciones de protección en la inmunidad, los neutrófilos también pueden mediar la lesión tisular e inmunopatología debido a la acumulación excesiva y / o la activación a sitios de inflamación, como se muestra en una variedad de enfermedades infecciosas y autoinmunes 5-7.

A pesar del papel indispensable de los neutrófilos en el montaje de la respuesta inmune innata eficaces y sus funciones efectoras pleiotrópicos en varias enfermedades infecciosas y afecciones inflamatorias, dificultades técnicas con el manejo de estas células y la falta de protocolos experimentales fiables ha dificultado la investigación con los neutrófilos en las últimas décadas. Por lo tanto, el uso de ensayos reproducibles para el aislamiento de los neutrófilos debería facilitar aún más la investigación sobre los neutrófilos mediada por inmunofunciones de lógica ex vivo e in vivo. Hasta la fecha, varios métodos han sido descritos para el aislamiento de neutrófilos, tales como centrifugación en gradiente de densidad de la sangre humana y la sangre o la médula ósea del ratón 8,9, enriquecimiento inmunomagnética positivo o negativo de los neutrófilos de la sangre o la médula ósea del ratón 10,11, y la cosecha de los neutrófilos de la cavidad peritoneal de los ratones después de la inyección intraperitoneal de tioglicolato o otros agentes inflamatorios 12. Aunque los neutrófilos pueden ser fácilmente aislados en grandes cantidades a partir de sangre humana, este método es subóptima en ratones debido al volumen limitado de sangre de ratón que se opone a aislamiento de neutrófilos suficientes para estudios funcionales o experimentos de transferencia adoptiva 13. Además, aunque el rendimiento de tioglicolato-suscitó las células de la cavidad peritoneal es mayor en comparación con la de la sangre del ratón, la pureza de los neutrófilos en el lavado peritoneal inflamatoria varía entre60-90%, y los neutrófilos aislados exhiben un fenotipo activado. Por lo tanto, las células recogidas usando este método sólo se puede utilizar para llevar a cabo estudios funcionales de activado, pero no de los neutrófilos no estimulados, como la cavidad peritoneal del ratón tiene pocos neutrófilos en el estado estacionario 12. En su lugar, la médula ósea es un depósito conveniente para la recolección de un gran número de neutrófilos no estimulados o activados ya sea 11,14, que luego se pueden utilizar para los estudios funcionales aguas abajo tales como la fagocitosis, la desgranulación y la matanza, o para la transferencia adoptiva en ratones receptores.

Aquí se describe un protocolo simple y rápido (~ 2 h), que proporciona un alto rendimiento (~ 6-12 × 10 6 neutrófilos / ratón no infectado, o hasta 30-40 × 10 6 neutrófilos / ratón infectado) puro de (80 -95%) los neutrófilos con> 95% de viabilidad de la médula ósea. Este método utiliza Histopaque disponibles comercialmente, que son la densidad de separación celular gradientemedios de racionamiento que consisten de Ficoll y diatrizoato de sodio, para separar los neutrófilos desde la médula ósea de los ratones. Este método produce un número significativamente mayor de neutrófilos por ratón en comparación con la sangre o la cavidad peritoneal, que puede ser utilizado para recoger los neutrófilos de ratones, tanto en estado estacionario o después de la infección, y es más fácil a la capa en comparación con el método de centrifugación en gradiente de densidad discontinuo que utiliza gradientes de Percoll que consisten de 55% / 65% / 75% de Percoll en PBS 9. Además, el tiempo y los recursos necesarios para recoger los neutrófilos puras se redujo significativamente en comparación con el uso de aislamiento de neutrófilos activados por fluorescencia de clasificación de células. También, ya que este método no implica una etapa de enriquecimiento inmunomagnética, es más rentable, y que evita la exposición de las células a la columna magnética y anticuerpos, disminuyendo así la probabilidad de activación de neutrófilos.

Además de realizar estudios funcionales de neutroph aisladoILS ex vivo y la transferencia adoptiva de células en ratones receptores, este protocolo también describe un método para el etiquetado de los neutrófilos aislados utilizando diferentes colorantes CellTracker. Etiquetado diferencial de los neutrófilos de ratones de diferentes orígenes genéticos se puede adaptar en los estudios de repoblación competitivos para el seguimiento de los neutrófilos transferidos en los tejidos de los ratones receptores usando citometría de flujo, que puede proporcionar una visión mecanicista sobre el papel directo de los genes específicos en el tráfico de neutrófilos de la sangre en órganos diana inflamadas 6.

Protocol

1. Aislamiento de células de médula ósea de ratón La eutanasia a los ratones que usan el protocolo de cuidado de animales de la institución comité aprobado y rociar la superficie del animal con 70% de etanol. Hacer una incisión de la piel en la mitad del abdomen y quitar la piel de la parte distal del ratón incluyendo la piel que cubre las extremidades inferiores. Cortar los músculos de las extremidades inferiores con unas tijeras y dislocar cuidadosamente el acetábulo de la arti…

Representative Results

Este protocolo se ha optimizado para la cosecha de células de médula ósea de los ratones y la posterior separación de los neutrófilos de estas células por centrifugación en gradiente de densidad utilizando Histopaque medios de separación de células disponibles comercialmente. Los neutrófilos aislados utilizando este método se puede utilizar para una variedad de estudios de aguas abajo funcional ex vivo y para los experimentos de transferencia adoptiva en ratones receptores. <p class="jove_content…

Discussion

En este documento se presenta un protocolo fiable, sencillo, rápido y económico para el aislamiento de un gran número de neutrófilos desde la médula ósea de ratones con alta pureza y la viabilidad utilizando un enfoque de centrifugación en gradiente de densidad. Cuando este protocolo se lleva a cabo correctamente, ~ 6-12 × 10 6 neutrófilos pueden ser recuperados de un ratón no infectado y un máximo de ~ 30-40 × 10 6 neutrófilos pueden aislarse a partir de un ratón después de la infec…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), el Instituto Nacional de Salud (NIH), EE.UU..

Todos los ratones fueron mantenidos a una Asociación Americana para la Acreditación de la instalación para animales acreditado Cuidado de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) y alojados de conformidad con los procedimientos establecidos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio bajo los auspicios de un protocolo aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo del NIAID.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
      Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES Cellgro 10-041-CV  
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) GemCell 100500  
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140  
0.5 M EDTA Quality Biological Inc 351-027-101  
0.2% and 1.6% sodium chloride JT Baker 3624 Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077 Sigma 10771 Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119 Sigma 11191 Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium Cellgro 210-40-CV  
Ethyl Alcohol (200 proof) The Warner Graham Company 64-17-5  
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) Invitrogen C-7025 Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) Invitrogen C-2927 Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) eBioscience 170451-82  
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 551461  
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 560599  
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) eBioscience 47-0112-82  
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) BD Pharmingen 553141 Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Molecular Probes L-23105 Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma 67-68-5  
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS USB Corporation 19943  
      Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
      Materials
C57BL/6 mice Taconic    
15 ml centrifuge tubes Corning 430053  
50 ml centrifuge tubes BD Falcon 352070  
25 ml serological pipettes Celltreat 229225B  
10 ml serological pipettes Celltreat 229210B  
5 ml serological pipettes Celltreat 229205B  
Pasteur pipettes (3 ml) BD Falcon 357575  
12 ml syringes Kendall monoject 512878  
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) BD 305122  
100 mm cell strainers BD Falcon 352360  
Bactericidal Petri dishes BD Falcon 351029  
Combitips Plus Biopur Eppendorf 2249608-5  
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) Biomedical Research Instruments 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 Instruments sterilized prior to use
      Equipment
Tissue culture hood The Baker Company SG403  
Refrigerated centrifuge Thermo Fischer Scientific 75004521  
37 °C shaking water bath Thermo Fischer Scientific 3166721  
      Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.

References

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Citer Cet Article
Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J. Vis. Exp. (77), e50586, doi:10.3791/50586 (2013).

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