אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס
Summary
קולוניזציה של nasopharynx מורין עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס ואת החילוץ הבא של תאים חסידיים או מגויסים מתואר. טכניקה זו כרוכה בשטיפת nasopharynx ואיסוף של הנוזל דרך nares והוא מסתגל לקריאות שונות, כולל כימות תאים דיפרנציאלי וניתוח של ביטוי mRNA באתרו.
Abstract
קולוניזציה Nasopharyngeal על ידי דלקת ריאות סטרפטוקוקוס הוא תנאי מוקדם לפלישה לריאות או למחזור הדם1. אורגניזם זה מסוגל ליישב את פני השטח הריריים של האף, שם הוא יכול להתגורר, להתרבות ובסופו של דבר להתגבר על הגנות מארח לפלוש לרקמות אחרות של המארח. הקמת זיהום בדרכי הנשימה התחתונות בדרך כלל גורמת לדלקת ריאות. לחלופין, החיידקים יכולים להפיץ למחזור הדם גרימת bacteraemia, אשר קשורה שיעורי תמותה גבוהים2, או אחר להוביל ישירות להתפתחות של דלקת קרום המוח פנאומוקוקית. הבנת הקינטיקה של, ותגובות חיסוניות, קולוניזציה האף הוא היבט חשוב של S. מודלים זיהום דלקת ריאות.
מודל העכבר שלנו של קולוניזציה תוך-אפית מותאם ממודלים אנושיים3 ומשמש קבוצות מחקר מרובות במחקר של תגובות מארח-פתוגן ב nasopharynx4-7. בחלק הראשון של המודל, אנו משתמשים בבידוד קליני של דלקת ריאות S. כדי להקים קולוניזציה חיידקית המגבילה את עצמה הדומה לאירועי כרכרה אצל מבוגרים אנושיים. ההליך המפורט בזאת כרוך בהכנת אינוקולום חיידקי, ואחריו הקמת אירוע קולוניזציה באמצעות מסירת האינוקולום באמצעות מסלול פנימי של הממשל. מקרופאגים מקומיים הם סוג התא השולט ב nasopharynx במהלך המצב היציב. בדרך כלל, יש מעט לימפוציטים נוכחים בעכברים לא מושפעים8, אולם קולוניזציה הרירית תוביל לדלקת בדרגה נמוכה עד גבוהה (בהתאם לארסיות של מיני החיידקים והזן) שתביא לתגובה חיסונית ולגיוס הבא של תאי חיסון מארחים. תאים אלה יכולים להיות מבודדים על ידי שטיפת תכולת קנה הנשימה דרך nares, בקורלציה לצפיפות של חיידקי קולוניזציה כדי להבין טוב יותר את הקינטיקה של הזיהום.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה הצגנו שיטות מפורטות עבור הקולוניזציה התוך-אפית של עכברים באמצעות זן מבודד קליני של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס ואת הבידוד והאפיון הבאים של תאי החיסון שגויסו nasopharynx בתגובה לחיידקים. הדגמנו כיצד אינוקולום חיידקי יכול להיות מתורבת במדיה עשירה בחומרים מזינים ומשמש להקמת אירוע קולו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות ד”ר ג’פרי ויזר של אוניברסיטת פנסילבניה על המתנה שלו של זנים קליניים של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הקנדיים לחקר הבריאות. קורות החיים מומנו על ידי מלגת M. G. DeGroote ומלגה מטעם האגודה הקנדית לבית החזה. עבודה זו מומנה על ידי איגוד הריאות של אונטריו והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR). העבודה במעבדה של בודיש נתמכת בחלקה על ידי מרכז מייקל ג’ דהגרוטה לחקר מחלות זיהומיות והמרכז לחקר האימונולוגיה של מקמסטר.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Anti-Mouse Ly6C FITC | BD Pharmingen | 553104 | |
| Anti-Mouse Ly6G PE | BD Pharmingen | ||
| Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 | eBioscience | 48-0453-82 | |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen APC | eBioscience | 17-4801-82 | |
| Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 | eBioscience | 25-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0032-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC | eBioscience | 93-0041-42 | |
| Intramedic Polyethylene Tubing – PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| BD 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| BD 26G3/8 Intradermal Bevel | Becton Dickinson | 305110 | |
| Buffer RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton Dickinson | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | PML Microbiologicals | A0404 | |
| RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0253L | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 |
References
- Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
- McCool, T. L., Cate, T. R., et al. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
- Nelson, A., Roche, A. M., et al. Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).
- van Rossum, A., Lysenko, E., et al. Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model. Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).
- Barocchi, M. A., Ries, J., et al. A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).
- Malley, R., Henneke, P., et al. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).
- McCool, T. L., Weiser, J. N. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).
- Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).
- Jeong, D., Jeong, E., et al. Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice. Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).
- Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., et al. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position. Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).
- Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
- Briles, D. E., Novak, L. Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).
- Wu, H. -. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
- Mo, Y., Wan, R., et al. Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research. Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).
- Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).
- Zhang, Q., Leong, S. C., et al. Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Briles, D. E., Novak, L., et al. Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).
- Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5, (2009).
- Bryant, W. P., J, , et al. Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I.. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
- Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).
- Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential. J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).
- Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia. Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).
- Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
- Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice. J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).
- Parker, D., Martin, F. J., et al. Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract. MBio. 2, (2011).
- Haya, D. L., Camilli, A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).
- Nakamura, S., Favis, K. M., et al. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).
- Kim, J. O., Weiser, J. N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).
- Roche, A. M., King, S. J., et al. Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice. Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).
- Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
- Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
- Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease. Immunobiology. , 215-251 (2010).
- Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and. 184, 3508-3520 (2002).
- Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
- Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease. Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
