Summary

טריפסין תקציר פרוטוקול לניתוח בכלי הדם של רשתית מודל עכבר

Published: June 13, 2013
doi:

Summary

טריפסין עיכול הוא אחת מהשיטות הנפוצות ביותר לניתוח כלי הדם ברשתית. כתב יד זה מתאר את השיטה בפירוט, כולל שינויים מרכזיים כדי לייעל את הטכניקה ולהסיר את הרקמה ללא כלי הדם תוך השמירה על הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם.

Abstract

טריפסין עיכול הוא שיטת תקן זהב לניתוח בכלי הדם ברשתית 1-5. זה מאפשר הדמיה של כל הרשת מורכב של כלי תלת ממדים ברשתית ונימי דם על ידי יצירת שטוח הר דו ממדי של כלי הדם המחוברים בין הערוצים לאחר עיכול של המרכיבים שאינם בכלי הדם של הרשתית. זה מאפשר לאדם ללמוד שינויים פתולוגיים בכלי הדם שונים, כגון microaneurysms, ניוון נימים, והאנדותל נורמלי ליחסי pericyte. עם זאת, השיטה היא מאתגרת מבחינה טכנית, במיוחד בעכברים, שהפך למודל של בעלי החיים באופן נרחב ביותר שקיימים כדי ללמוד את הרשתית בגלל הקלות של מניפולציות גנטיות 6,7. בעיני העכבר, זה קשה במיוחד להסרה מלא של רכיבים שאינם כלי הדם, תוך שמירה על הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם ברשתית. נכון להיום, קיים מחסור בספרות המתארת ​​את הטכניקה לעכל טריפסין בפירוט אניn העכבר. כתב יד זה מספק מתודולוגיה צעד אחר צעד מפורט של לעכל טריפסין ברשתית עכבר, תוך מתן גם טיפים על שלבים לפתרון בעיה קשים.

Introduction

לדמיין את כלי הדם של הרשתית היא גישה מאוד חשוב לנתח את המנגנונים של מחלות עיניים שונות, כגון רטינופתיה סוכרתית. זה מאפשר לאדם להעריך את ליקויים בכלי הדם המוקדמים, כולל microaneurysms, ניוון נימים, ואובדן pericyte 8,9. עד כה, היו מספר טכניקות שפותחו לניתוח בכלי הדם ברשתית. טפטוף של צבעים שונים נעשה שימוש כדי לסמן את הכלים, אבל כולם חלקו מגבלות דומות. לעתים רחוקות הזרקה מדגישה את כלי הדם ברשתית כולה, אלא אם כן ניתנו בלחץ גבוה, המסכן את פקיעת ופגיעה בכולים 1. Immunostaining של האנדותל של כלי דם שבכותרת fluorophore G isolectin B4 (אלקסה פלואוריד 594 מצומדות; I21413; Invitrogen; 1:100 דילול) וmounts שטוח רשתית יכול להדגיש את הארכיטקטורה הכוללת של כלי, אבל בלי הדמיה מפורטת של נימי דם, קרומי מרתף וpericytes . צוין על ידיפרידנוואלד שיכול להיות מודגש על ידי צביעת כלי שטוח mounts של רשתית עם תקופתי חומצה שיף (PAS) או hematoxylin ו eosin (H & E) מכתים 10. עם זאת, הצביעה הייתה לא ספציפית לכלי, והדגישה את הרקמה ללא כלי הדם, כמו גם, ולכן קשה להבדיל בין הכלים. בשנתי ה -1960, קוגן וKuwabara פיתחה את הטכניקה לעכל טריפסין שעשה את זה קל יותר לדמיין את כלי הדם ברשתית על ידי לעכל את מרכיבי nonvascular של הרשתית 1. מאז אותו הזמן, לעכל טריפסין הפכה את שיטת תקן זהב בניתוח בכלי הדם של רשתית 2-5. עם זאת, חשוב לציין כי טכניקות חלופיות אחרות כדי לבודד את כלי הדם כבר תאר. השימוש בתמוגה האוסמוטי נעשתה שימוש כדי לבודד את כלי הדם ומאפשר מחקרים ביוכימיים של רקמת 11,12, אך ההליך לא נעשה שימוש כדרך עיקרי ללימוד אנטומי. שיטת הדפסת הרקמות כברמשמש לבודד חלקים גדולים של microvasculature ומאפשר את היכולת ללמוד ארכיטקטורת electrotonic של כלי הדם 13. בתאוריה, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את השינויים אנטומיים, כמו האיכות של כלי היא גבוהה. עם זאת, הוא רק הצליח לבודד מקטעים של רשת כלי הדם כולו. למרות ששיטות אלה לא יכולים להחליף טריפסין לעכל, חשוב לציין שיש להם יתרונות וחסרונות שונים ומשלימים בעניין זה.

שיטת עיכול טריפסין היא מאתגרת מבחינה טכנית וקשה לביצוע באופן עקבי 6,7. יתר על כן, כבר ציין כי טריפסין לעכל קשה במיוחד במודל של עכברים, במיוחד אם אחד רצונות כדי לשמר את הארכיטקטורה הכללית של כלי הדם ברשתית 6,7. אתגרים כוללים (1) יתר מערכת העיכול של הרשתית שגורמת לאובדן של שניהם בכלי הדם, כמו גם רקמה ללא כלי דם, (2) מתחת לעיכול, הדורשיםנתיחה מכאנית נרחבת אשר עלולה להוביל לנזק של כלי המיטה, (3) הפרדה לקויה של הרקמות שאינן כלי דם מכלי הדם שמוביל לכתמים שאינם ספציפיים. כמה כתבי יד הדגישו האתגרים הללו, אבל אף סיפקו פרוטוקול מפורט ועקבי כדי להתגבר עליהם 14,15. כתב יד זה יציג מתודולוגיה צעד אחר צעד המפרטת את הטכניקה לביצוע לעכל טריפסין על רשתיות עכבר וחולדה עם עצות ספציפיות בטיפול בשלבים הקשים במיוחד. סקירה סכמטית מוצגת באיור 1.

Protocol

1. הכנת רשתית Enucleate עין העכבר. שימוש ביד אחת, לפתוח את עפעפי העין, כך שהעין גלויה. ביד השנייה, תוך שימוש במלקחיים מעוקלים כלפי מעלה (מול מעוגל), להפעיל לחץ על היבטים עליונים ונחותים של המסלול עד שבולט הגלובוס. בעדינות לסגו…

Representative Results

התוצר הסופי של הליך מוצלח הוא בעלת הר בכל הרשת של כלי הדם ברשתית העכבר, עם שמרה על האדריכלות, מוכתם גם PAS / hematoxylin או H & E, כפי שמוצג באיורים 2-4. הבחנה ברורה של תאי האנדותל וpericytes ניתן לראות, כפי שמוצגת באיור 3. ברשתית, הגרעינים של תאי האנדותל הם סגלגלים א…

Discussion

טריפסין עיכול הוא שיטה סטנדרטית על מנת להעריך בכלי הדם של הרשתית. למרבה הצער, זה מאתגר מבחינה טכנית ויכול לגרום לשיעור גבוה של אובדן דגימה אם לא מבוצע כהלכה. יתר על כן, ההליך הוא קשה במיוחד בעכברים, מה שיכול להגביל את היישום של טכניקה זו במודלים של בעלי החיים הגנטיים הנ…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH RO1-EY019951 (AAF), חברת אילינוי למניעת עיוורון (מרכז קהילתי יהודי, משרת בחיל אוויר), קרנות בלתי מוגבלות למחלקת עיניים ממחקר למניעת עיוורון (RPB), ניו יורק וRPB הרפואי הסטודנטים המלגה גרנט (JCC).

Materials

      REAGENTS
10% neutral buffered formalin Fischer Scientific SF100-4  
Trypsin (1:250) Amresco 0458-50G Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base Sigma T1503-1KG Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA Sigma T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle Millipore SCGPS05RE Create filtered water
      EQUIPMENT
Dissecting microscope     Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors Fine Science Tools 15024-10 Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox) Dumont #5 11252-20 Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar) Dumont #7 11297-10 Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator Precision Scientific BDG59442 Shaker optional
24-well dish Falcon 353047  
Microscope Slides VWR 82027-132  

References

  1. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
  2. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
  3. Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
  4. Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
  5. Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
  6. Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
  7. Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
  8. Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
  9. . Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , (2005).
  10. Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. , (2008).
  11. Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
  12. Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
  13. Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
  14. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
  15. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
  16. Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
  17. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).

Play Video

Citer Cet Article
Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model. J. Vis. Exp. (76), e50489, doi:10.3791/50489 (2013).

View Video