쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션
Summary
We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.
Abstract
면역 조직 화학 (IHC)이 높은 특정 안정적이고 매력적인 단백질의 시각화를 제공합니다. IHC 기반의 빛깔 표지의 정확한 성능과 해석은 중추 신경계 (CNS) 등의 지방 함량이 높은 조직에서 목적 단백질 사이의 상호 관계를 평가하기 위해 사용될 때 특히 도전적이다.
우리의 프로토콜은 특히 쥐 CNS와 신경 염증에 의해 영향을받는 주변 림프절 (LN) 모두 구조 및 가용성 단백질의 검출을 위해 조정 된 표준 immunolabeling 기술의 정교화를 나타냅니다. 그럼에도 불구하고, 추가 수정하거나하지 않고, 우리의 프로토콜 가능성도 여기에 제시된 것보다 다른 기관과 종, 기타 관련 단백질 표적의 탐지를 위해 사용될 수있다.
Introduction
methylome, 사체 또는 프로테옴 수준에서 수행 분석 고급 높은 처리량의 사용에도 불구하고, 면역 염색은 조직 샘플, 세포 배양에 직접 단백질 검출 또는 세포 도말 검사의 황금 표준 남아있다. 지역화 / 배광 패턴을 계시하여 면역 조직 화학 (IHC)의 상대적인 비율과 목표 단백질의 지형적 상호 관계를 평가하고, 그들의 생물학적 활성을 나타낼 수있다. 따라서, IHC 널리 임상 연구 및 진단 목적, 예를 들면, 치료 평가 질병 메커니즘 동물 모델에서 기능적 표현형 변화 등의 연구에 활용
본질적 조직학, 병리학, 생화학 및 면역학을 포함 IHC 크게 형광 표지 된 항체는 감염된 조직 1 폐렴 구균 항원을 식별하기 위해 처음에 사용 된 1941 년 이후로 진행되었다. V휴대 제품과 IHC에 의해 구성 요소의 isualization은 특정 항원은 (Ag)에 대한 항체 (ABS)의 결합을 기반으로합니다. 형광 태그 된 항체를 사용하는 외에, 면역 반응은 2,3- 옥시다아제 또는 알칼리 포스 파타 아제와 같은 효소 (4)을 이용하여 가시화 될 수있다. 방사능 라벨자가 방사선 시각화하는 동안 또한, 콜로이드 금 항체 태그 (5)는 광학 및 전자 현미경 모두에 의해 특정 항원 항체 반응을 검출하기 위해 사용된다.
용 Ag-Ab의의 면역 직접 및 간접적 인 방법을 통해 검출 할 수있다. 직접적인 방법은 직접 차 애비 6 레이블 사용하기 때문에, 본질적으로 빠르고 간단합니다. 그러나, 감도 부족으로 심각한 간접 방법이 직접 사람에게 바람직하다. 두 단계 간접 검출 방법은 상기 제 7 층과 같은 기본 복근 향한 이차 복근 첫번째로, 표지되지 않은 기본 복근 및 표지 필요로한다.신호 증폭을 더 포함함으로써 달성 될 수 있으며, 효소 – 결합 급 순이 (세 단계 간접법) 보조 AB와 결합하는 것이다. 일반적으로 사용되는 간접 검출 방법은 아비딘 – 비오틴과 퍼 옥시 다제 – antiperoxidase (PAP)입니다. 대안 적으로, 알칼리성 포스파타제 antialkaline 포스파타제 (APAAP) 복합체 대신 PAP 방법을 사용할 수있다. 특히, 알칼리성 포스파타제 (AP) 방법은 immunoperoxidase 방법 4보다 더 민감한 것으로 나타납니다. 아비딘 – 비오틴 복합체 (ABC) 방법은 표지 아비딘 – 비오틴 복합체 (LAB) 중 하나와 함께 바이오틴 차 순이를 사용, 또는 스트렙 타비 딘 – 비오틴 복합체 (SLAB) 표지. 검출 감도는 상기 퍼 옥시다아제 또는 알칼리 포스 파타 아제 표지 아비딘 (8)를 포함함으로써 증가 될 수있다. 사용의 다른 검출 방법은 고분자 라벨, 타이 라민 증폭 및 면역 구름 원 9입니다. 특히, 다른 검출 방법은 동일한 조직에 다수의 Ag 검출을 위해 결합 될 수있다여기에 제시된 1978 4. 동시 이중 면역 염색에 처음보고 된 샘플은 각각, 퍼 옥시 다제 – 결합 및 AP 접합 이차 항체를 이용하여 포르말린 고정 된 파라핀 포매 쥐 CNS 및 LN 조직 절편에서 수행 하였다. 신호는 각각 (FB) APAAP 복잡한 3,3'- diaminobencidine (DAB) 색 원체 및 패스트 블루를 사용하여 시각화 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
표준 IHC 절차는 종종 일반적으로 폭 넓은 경험뿐만 아니라 "시행 착오"접근 방식을 의미 최적의 결과를 얻기 위해 특정 조정을 필요로한다. 티슈 제조에서 대상 가시화 될 때까지 상기 프로토콜 거의 각 단계는 개별적으로 최종 결과를 개선하기 위해 수정 설계를 실시 할 수있다. 여기에 제시된 이중 염색 프로토콜은 특히 신경 염증에 영향을 포르말린 고정 파라핀 포매 쥐 CNS 및 LN 조직 섹…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.
This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 – 100), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α- CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α- Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α- CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α- eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N- Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2M HCl (2N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-Tek V.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 |
References
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