Un método simple y eficiente para detectar la activación del factor nuclear en neutrófilos humanos por citometría de flujo
Summary
Los neutrófilos son las más abundantes en leucocitos de sangre. Los neutrófilos poseen funciones regulados transcripcionalmente tales como la producción de citocinas proinflamatorias y la inhibición de la apoptosis. Estas funciones pueden ser estudiadas con el método presentado aquí, que permite la detección y cuantificación de los factores nucleares por citometría de flujo en los núcleos aislados
Abstract
Los neutrófilos son las más abundantes en leucocitos de sangre periférica. Estas células son el primero en aparecer en sitios de inflamación e infección, convirtiéndose así en la primera línea de defensa contra los microorganismos invasores. Los neutrófilos poseen importantes funciones antimicrobianos, tales como fagocitosis, la liberación de enzimas líticas, y la producción de especies reactivas del oxígeno. Además de estas importantes funciones de defensa, neutrófilos realizar otras tareas en respuesta a la infección, tales como la producción de citocinas proinflamatorias y la inhibición de la apoptosis. Las citoquinas reclutar leucocitos otros que ayudan a eliminar la infección, y la inhibición de la apoptosis permite el neutrófilo a vivir más tiempo en el sitio de la infección. Estas funciones se regulan a nivel de la transcripción. Sin embargo, debido a los neutrófilos son las células de vida corta, el estudio de respuestas regulados transcripcionalmente en estas células no se puede realizar con los métodos convencionales de genes informadores ya que no hay eficienciatécnicas eficientes para la transfección de neutrófilos. Aquí, se presenta un método simple y eficiente que permite la detección y cuantificación de los factores nucleares en núcleos aislados y immunolabeled por citometría de flujo. Se describen técnicas para aislar los neutrófilos puros a partir de sangre periférica humana, estimular estas células con anticuerpos anti-receptor, aislar y núcleos inmunomarcador, y analizar núcleos por citometría de flujo. El método ha sido utilizado con éxito para detectar NF-kB y Elk-1 factores nucleares en los núcleos de los neutrófilos y otros tipos celulares. Por lo tanto, este método representa una opción para el análisis de la activación de factores de transcripción en los núcleos aislados a partir de una variedad de tipos de células.
Introduction
Los neutrófilos son las más abundantes en leucocitos de sangre periférica 1. Durante los neutrófilos inflamación y la infección son las primeras células que aparecen en el sitio afectado cuando actúan como la primera línea de defensa 2. Los neutrófilos poseen varios mecanismos antimicrobianos 3 incluyendo la fagocitosis, la producción de especies reactivas de oxígeno, liberación de enzimas líticas por la desgranulación y la producción de citocinas proinflamatorias 4,5. Los neutrófilos son las células de vida corta que se activa rápidamente a través de la señalización de los distintos receptores de la superficie celular. Aunque los neutrófilos se han considerado las células terminales debido a su corta vida y porque se someten a apoptosis menos que sea activado durante el proceso inflamatorio 6, ahora está claro que también pueden modificar su fenotipo cambiando el nivel de la transcripción de determinados genes. La producción de citocinas 5 y la inhibición de la apoptosis 7,8 son dos importantes de activación dependientes de funciones de la célula regulada en el nivel de transcripción en los neutrófilos. El factor nuclear kB (NF-kB) participa en el control transcripcional de la producción de citoquinas y 4 en la regulación de la supervivencia celular y la apoptosis 9-11 en varios tipos de células.
Las vías de señalización que conducen a la activación del factor nuclear generalmente se estudian por ensayos de gen reportero o por ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA). Sin embargo, debido a los neutrófilos son las células de vida corta, el estudio de respuestas regulados transcripcionalmente en estas células no se puede realizar con ensayos de gen reportero, ya que no hay técnicas eficaces para la transfección de neutrófilos. Ensayos de EMSA se han utilizado en los neutrófilos para explorar la activación del factor nuclear 12,13; sin embargo, esta metodología es complicada y cara, ya que implica el uso de materiales radiactivos. Nucleofection es otra técnica que se ha utilizado successfully para transfectar monocitos 14. Por lo tanto, al menos en teoría, la activación del factor nuclear puede ser detectado en los neutrófilos por transfección (a pesar de la baja eficiencia). Sin embargo, esta técnica sería más costoso, consume tiempo y, probablemente, menos cuantitativo. El análisis microscópico de células inmuno también podría ser utilizado para detectar los factores nucleares en el núcleo. En efecto, hemos detectado NF-kappa B translocación en el núcleo de esta manera 15. Desafortunadamente, esta técnica es también consume mucho tiempo, menos cuantitativo, y sujeto al sesgo del observador.
Aquí, se presenta un método simple y eficiente que permite la detección y cuantificación de los factores nucleares en núcleos aislados y immunolabeled por citometría de flujo. Se describen técnicas para aislar los neutrófilos de sangre periférica humana, estimular estas células a través de integrinas o receptores de Fc con anticuerpos anti-receptor, aislar y núcleos inmunomarcador, y analizar núcleos por citometría de flujo (Figura 1). El método ha sido utilizado con éxito para detectar NF-kB 15 y Elk-1 16 factores nucleares en los núcleos de neutrófilos. La sensibilidad de este método permite la detección de pequeños cambios en los niveles de factor nuclear en el núcleo. Este método también se puede utilizar para analizar el nivel de factores de transcripción en los núcleos de otros tipos de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de purificación descrito aquí permite el aislamiento de neutrófilos no estimulados (PMN) con una pureza mayor que 95% (evaluado por observación microscópica), en un corto tiempo. A veces, los neutrófilos pueden estar contaminados por los eritrocitos, si éste no se lisan completamente. Esto no suele afectar a la técnica, ya que los eritrocitos y los PMN se pueden distinguir fácilmente como poblaciones celulares distintas por citometría de flujo. Aislado PMN entonces puede ser estimulado por los recep…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Nancy Mora por su asistencia técnica.
Este trabajo fue financiado por becas de investigación 48573-M y 168098 de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México, y por subvenciones IN212308 y IN205311-2 de Dirección General de Asuntos del Personal Académico de la Universidad Nacional Autónoma de México, México.
Materials
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur |
References
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
