Summary

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Published: July 18, 2013
doi:

Summary

Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Abstract

Önemli çabalar büyük ölçekli kapsamlı protein-protein etkileşimleri ağ haritaları oluşturmak için toplanmıştır. Bu patojen-konakçı ilişkileri anlamak için etkili olup, esas olarak maya iki-hibrid sistem genetik gösterimleri ile gerçekleştirildi. Bir Gaussia lusiferaz tabanlı parçası tamamlama yöntemi ile protein-protein etkileşimleri algılama son gelişme şimdi titizlikle hücresel faktörlerin ortak bir dizi karşı farklı patojen gerginlik seçenekleri arasından proteinlerin etkileşim profillerinin karşılaştırılması gerekli bütünleştirici karşılaştırmalı interactomic yaklaşımlar geliştirme fırsatı sunuyor.

Bu kağıt özellikle protein-protein etkileşimleri veri setleri oluşturmak için iki dik yöntem birleştirme programı üzerinde duruluyor: maya iki hibrid (Y2H) ve yeni bir tahlil, memeli hücrelerinde yapılan yüksek verimli Gaussia princeps'in protein tamamlama testi (HT-GPCA).

nt "bir patojen protein hücre ortaklar> büyük ölçekli bir kimlik birden fazla patojen suşu türevleri kullanılarak cDNA kütüphaneleri iki-hibrid gösterimleri çiftleşme tabanlı maya tarafından gerçekleştirilir. yüksek güven istatistiksel puanlama seçilen etkileşim ortakların bir alt kümesi daha fazla olduğunu HT-GPCA kullanarak patojen türevleri proteinlerin tüm set ile çift-bilge etkileşimleri için memeli hücrelerinde geçerli. birbirini tamamlayan iki yöntem kombinasyonu etkileşim veri kümesi sağlamlığı artırır ve sıkı bir karşılaştırmalı etkileşim analizi performans sağlar. Böyle karşılaştırmalı interactomics deşifre herhangi bir patojen-ana interplays için güvenilir ve güçlü bir strateji oluşturmaktadır.

Introduction

Protein-protein etkileşimleri haritaları oluşturmak için toplanan verilerin artan miktarda daha fazla patojen enfeksiyonları anlamak için perspektifler açar. Patojen enfeksiyonların küresel anlayış ortaya çıkmaya başladığında, bu insan proteom 1 bağlanırken patojenler proteinlerin neden olduğu tedirginlikler aralığında erişim sağlar. Bu sayede patojenlerin konak hücre makine işlemek nasıl anlamak için bir yol sunar. Özellikle, birçok viral-host etkileşim ağlarının haritalama viral proteinler tercihen yüksek (hub) hücresel ağa bağlı, ya da bir ağ (darboğazları proteinler) 2-4 birçok yollara merkezi olduğunu ana protein hedef ortaya koydu. Bu etkileşimler bulaşıcı döl çoğaltmak ve üretmek için enstrümantal olan virüsler önemli hücresel süreçleri işlemek için izin verir. Karşılaştırmalı etkileşimleri haritalama son göre bilgileri ayıklamak amacı ile ilgili virüsler üzerinde yapılmıştırpatogenezi 4. Ayrıca, ev sahibi-patojen etkileşimleri peyzaj çalışmaları birçok patojen 5 genişletilmiştir. Hedeflenen hücre faktörler kimlik hücreleri enfekte için patojenler tarafından kullanılan stratejileri içine bilgiler sağlar ve potansiyel patojen belirteçlerin algılanmasını sağlar.

Maya iki hibrid sistemi genetik tarama protein-protein etkileşimleri yüksek verimli haritalama için verimli ve hassas bir araç olduğu için ikili etkileşimleri tanımlamak için en popüler yöntemdir. Yaklaşım, böylece patojen-ana protein-protein etkileşimleri karşılaştırmalı bir bakış erişim sağlayan, birden fazla patojen gerginlik türevleri bir protein değerlendirerek bireysel Y2H gösterimleri geliştirir Burada önerilen. Bunun toplam etkileşimleri 6 yaklaşık% 20 kurtarır Dahası, maya iki hibrit tarama önemli bir sınırlama, yüksek yanlış negatif oranı yatıyor. Bu pato yalnızca bir alt kümesini ile tespit bu etkileşimleri imagens türevleri başkalarıyla algılama kaçmış olabilir. Bu nedenle, tüm iki-hibrid gösterimleri çıkan bireysel ortaklar daha karşılaştırmalı etkileşim veri setleri sağlayarak, çalışılan suşları tam yelpazesi ile etkileşim için zorlanmaktadır. Farklı yöntemler birleştirerek güçlü protein-protein etkileşimi veri setleri 7 sağlamlığını artırır olduğu gösterilmiştir, çünkü bu doğrulama HT-GPCA 8 olarak adlandırılan yeni geliştirilmiş bir protein fragmanı tamamlama analizi ile memeli hücrelerinde gerçekleştirilir. Bu hücre-tabanlı sistem Gaussia princeps'in complemantasyon protein etkileşimlerinin saptanmasında lusiferaz bölünmüş ve yüksek verimli bir formatta ile uyumlu olacak şekilde tasarlanmıştır sağlar. Onun lüminesans tabanlı teknoloji sayesinde ve düşük arka plan gürültü diğer floresan bazlı analiz ile karşılaştırıldığında, HT-GPCA çarpıcı yüksek hassasiyet gösterir.

Genel olarak, bu yaklaşım, etkin bir teşkilkaçırma konak hücre küresel bir anlayış doğru ilk adımı temsil konak-patojen interplays kapsamlı haritalama, oluşturmak için bir araç.

Protocol

1. Maya İki melez Gösterimleri Aşağıdaki gerekli çözümleri olun: Komple Sentetik Drop Out (SD): 1 su L glukoz ile minimum SD tabanının 26.7 g çözülür. Aşağıdaki gibi elde amino asit karışımı, 2 g ekleyin 2 g Adenin hemisülfat, 2 gr Arginin HCI, 2 gr Histidin HCI, 2 gr izolösin, lösin 4 gr, 2 gr Lizin HCI, 2 gr Metionin, Fenilalanin 3 g, 2 g L -Serin, 2 gr L-treonin, 3 g Triptofan, Tirosin 2 gr, 1.2 gr urasil, 9 g Valin. <…

Representative Results

Şekil 2'de HPV E2 protein (referans 13 uyarlanmıştır) için yanlış pozitif ve yanlış negatif oranları değerlendirilmesi ile gösterildiği gibi HT-GPCA önemli bir gücü, yüksek hassasiyet yatıyor. Yanlış negatif oranını belirlemek için, HPV16 gelen E2 bilinen etkileşimleri HT-GPCA (Şekil 2A) ile değerlendirildi. 18 etkileşimleri dışında dört (% 22 yanlış negatif oranı karşılık gelen) geri değildi. Yanlış pozitif etkileşimleri hücresel proteinler…

Discussion

Bağımsız, maya-iki gibi GST açılır, Lumier veya MAPPIT gibi hibrid ve memeli etkileşim deneyleri, protein-protein etkileşimleri tespit etmek için etkili araçlar olduğu kanıtlanmış, ama yanlış pozitif ve yanlış-negatif yüksek oranda sınırlıdır etkileşimler bu teknikler 15 ile ilgilidir. Ayrıca, kanıt dik yöntemleri birleştirerek elde edilen etkileşim veri kümesi 7 güvenilirliğini artırdığını büyüyor. HT-GPCA tekniğin son gelişmeler, memeli hücrelerinde ikili…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Institut Pasteur fon tarafından ve Ligue Nationale contre le Kanser (hibe R05/75-129 ve RS07/75-75), Derneği pour la Recherche sur le Kanser (/ hibe ARC A09 hibe kısmen desteklenmiştir 1/5031 ve 4867) ve Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 ve ANR09 MIEN 026 01). MM bir MENRT dostluk bir alıcı oldu.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Yeast strains Clontech    
Minimal SD base US biological D9500  
Amino acids Sigma    
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Acros organics 264571000  
Zymolase Seikagaku 120491  
DMEM Gibco-Life Technologies 31966  
Fetal bovine serum BioWest S1810  
Phosphate buffer Saline (PBS) Gibco-Life Technologies 14190  
Penicillin-Streptomycin Gibco-Life Technologies 15140  
Trypsin-EDTA Gibco-Life Technologies 25300  
Renilla luciferase assay Promega E2820  
White culture plate Greiner Bio-One 655083  
96-wellPCR plates 4titude 4t-i0730/C  
Incubator (30 °C) Memmert    
Incubator (37 °C) Heraeus    
Luminometer Berthold Centro XS-LB 960  

References

  1. Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
  2. Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
  3. de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
  4. Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
  5. Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
  6. Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
  7. Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
  8. Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
  9. Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
  10. Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
  11. Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
  12. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
  13. Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
  14. Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
  15. Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).

Play Video

Citer Cet Article
Muller, M., Cassonnet, P., Favre, M., Jacob, Y., Demeret, C. A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (77), e50404, doi:10.3791/50404 (2013).

View Video