Gennemførelse Dynamic Clamp med Synaptic og Artificial konduktanser i Mus retina-ganglieceller
Summary
Denne video artikel illustrerer set-up, de procedurer til at lappe celle organer og hvordan man gennemfører dynamiske clamp optagelser fra ganglion celler i hel-mount mus retinae. Denne teknik gør det muligt at undersøge den præcise bidrag excitatoriske og hæmmende synaptiske input, og deres relative størrelse og timing at neuronal spiking.
Abstract
Ganglieceller er output neuroner i nethinden og deres aktivitet afspejler integration af flere synaptiske input i forbindelse med specifikke neurale kredsløb. Patch clamp teknikker i spænding klemme og strømtang konfigurationer er almindeligt anvendt til at studere de fysiologiske egenskaber af neuroner og at beskrive deres synaptiske input. Selvom anvendelsen af disse teknikker er meget informative, de udgør forskellige begrænsninger. For eksempel er det vanskeligt at kvantificere hvordan de præcise interaktioner af excitatoriske og hæmmende input bestemme respons output. For at løse dette problem, vi brugte en modificeret strømtang teknik, dynamisk klemme, også kaldet ledeevne clamp 1, 2, 3 og undersøgt virkningerne af excitatoriske og hæmmende synaptiske input på neuronal uro. Denne teknik kræver injektion af strøm ind i cellen og er afhængig af den tidstro tilbagemelding sin membranpotentiale på det tidspunkt. Den injected strøm beregnes ud fra forudbestemte excitatoriske og hæmmende synaptiske konduktanser, deres tilbageførsel potentialer og cellens øjeblikkelige membran potentiale. Nærmere oplysninger om de eksperimentelle procedurer, der er patch fastspænding celler for at opnå en hel-celle konfiguration og beskæftigelse af den dynamiske clamp teknik illustreret i denne video artiklen. Her viser vi svarene fra muse retina-ganglieceller til forskellige ledningsevne waveforms fås fra fysiologiske eksperimenter kontrol forhold eller i nærværelse af narkotika. Derudover viser vi brug af kunstige excitatoriske og hæmmende konduktanser genereret med alfa-funktioner til at undersøge svarene fra cellerne.
Introduction
Nethinden er en nær-gennemsigtig neuralt væv foring bagsiden af øjet. Mange undersøgelser bruger nethinden som model til at undersøge de første skridt i visuel bearbejdning og mekanismer synaptiske signalering. Da den retinale netværk i hele-mount præparat forbliver intakte efter dissektion, det repræsenterer et ideelt system til at studere synaptiske interaktioner dets fysiologiske reaktioner er meget lig den in vivo. Således bruger en isoleret nethinden egenskaber sine neuroner kan studeres ved hjælp af patch clamp teknikker (efter anmeldelser på teknikken, 6,9,13 se). Identifikation af den nøjagtige bidrag bestemte kredsløb og neurotransmittere til ganglioncelle respons, imidlertid sædvanligvis hindres som farmakologiske midler virker på forskellige steder.
Fysiologiske reaktioner i nethindens neuroner for lys, den naturlige stimulus, kan optages med glaspipetter fyldt med intracellulær væske. Brug patch clamp teknikker, neuronale reaktioner på lys stimulation kan optages som membranpotentialet udsving (strømtang) eller som strømme (spænding klemme). Ved at holde membranpotentialet ved forskellige spændinger og gennemføre en efterfølgende konduktans analyse er det muligt at isolere hæmmende og stimulerende synaptiske input 5,12. Denne type eksperimenter kan udføres i normal badning medium og i nærvær af forskellige farmakologiske midler at isolere bidrag af forskellige neurotransmittere og receptorer til neuronale reaktioner. Et væld af undersøgelser fra mange laboratorier præget afhængighed af spiking output og stimulerende og hæmmende indgange på stimulus egenskaber såsom størrelse, kontrast, rumlige og tidslige frekvenser, retning, orientering og andre stimulus variabler. Selv om disse eksperimentelle metoder giver oplysninger om forholdet mellem spike udgang og synaptiske input som en funktion af stimulus egenskaber,fortolkning af bidrag fra bestemte celletyper og deres synaptiske input til celle uro er ikke ligetil. Dette skyldes det faktum, at typisk både stimulerende og hæmmende input varierer med stimulerende egenskaber og dermed er det ikke muligt at vurdere den nøjagtige virkning, at ændringer i en af disse indgange har på neuronal spiking.
En alternativ metode til at omgå disse begrænsninger er at udføre dynamiske clamp optagelser, som giver en kritisk vurdering af det bidrag, de enkelte synaptiske input til spiking output. Den dynamiske clamp teknik muliggør direkte injektion af strøm i cellen, og mængden af strøm injiceret på et givet tidspunkt afhænger af den registrerede membranpotentialet dengang 1,2,3 (for en oversigt, 7,14 se). Det er en modificeret strømtang set-up, hvor en realtid, hurtige feedback samspillet mellem cellen under optagelse og udstyr, der omfatter specialiserede hardware, softwareog en computer er opnået. Mængden af strøm injiceret i cellen beregnes i overensstemmelse hermed. Derfor er den fordel ved denne fremgangsmåde er, at cellen kan stimuleres med forskellige kombinationer af konduktans bølgeformer, og dens reaktion vil efterligne aktiveringen af receptorer, der medierer synaptiske input. For eksempel kun sammenligning af respons på injektion af stimulerende og hæmmende konduktanser for en lille plet med respons på injektion af ekscitatorisk ledningsevne for en lille plet giver oplysninger om virkningen af hæmningen af celle respons. På samme måde kan andre kombinationer af fysiologisk indspillede konduktanser co-injiceres at afsløre, hvordan stimulus-afhængige ændringer i excitatoriske og / eller hæmmende konduktanser påvirker spike output.
I vores undersøgelse er den dynamiske clamp teknik, der anvendes til at påvise virkningen af den relative amplitude og timingen af synaptiske input på standpladsen egenskaber retina-ganglieceller. Forskellige konduktanseropnået fra fysiologiske eksperimenter i kontrolrum forhold eller i nærværelse af farmakologiske midler var ansat som input. Desuden blev kunstige konduktanser baseret på alfa-funktioner også anvendes med henblik på at undersøge, hvordan synaptiske input integreres af neuroner. Dette er således en alsidig teknik, der tillader forskellige typer af konduktans frembringes enten fysiologisk, farmakologisk eller beregningsmæssigt skal injiceres i den samme ganglieceller, kan så sammenligning af svarene på disse indgange gøres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser vi brug af dynamisk klemme at vurdere indflydelsen af forholdet og den relative timing af excitation og hæmning af retina-ganglieceller output. Dynamisk klemme gør brug af computersimuleringer for at indføre fysiologisk optagede eller kunstige synaptiske konduktanser i levende neuroner. Denne metode giver et interaktivt værktøj, som konduktanser kan ændres og injiceres i neuroner computing deres indflydelse på neuronale reaktioner. Konduktans kurveformer kan fås fra eksperimenter, hvor visuelle s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af Australian Research Council (ARC DP0988227) og Biomedical Science Research Initiative Grant fra Discipline of Biomedical Science, The University of Sydney. Udstyret Patch Clamp Forstærker EPC 8 blev finansieret af Startup fonden fra Discipline of Biomedical Science, The University of Sydney. Udstyret InstruTECH LIH 8 +8 Data Acquisition System blev købt med midler fra Rebecca L. Cooper Foundation og Startup fonden fra Discipline of Biomedical Science, The University of Sydney. Vi vil gerne takke de anonyme korrekturlæsere for deres indsigtsfulde forslag og kommentarer.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Microelectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith & Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation |
References
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -. S. . Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).
- Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
