Uitvoering Dynamic Klem met Synaptic en kunstmatige geleidingen Mouse in retinale ganglioncellen
Summary
Deze video artikel illustreert de set-up, de procedures te cellichamen patchen en hoe u dynamische clamp opnames implementeren van ganglioncellen in zijn geheel-mount muis retinae. Deze techniek maakt het onderzoek de exacte rol prikkelende en remmende synaptische inputs, en hun relatieve omvang en timing neuronale spiking.
Abstract
Ganglioncellen de output vormen van de retina en de activiteit weerspiegelt de integratie van meerdere synaptische inputs die samenhangen met specifieke neurale circuits. Patch-clamp technieken, in voltage en stroom clamp clamp configuraties worden gewoonlijk gebruikt om de fysiologische eigenschappen van neuronen te bestuderen en om hun synaptische inputs karakteriseren. Hoewel de toepassing van deze technieken is zeer informatief, zij vormen diverse beperkingen. Bijvoorbeeld, is het moeilijk te kwantificeren hoe de precieze interacties van prikkelende en remmende inputs bepalen reactie output. Om dit probleem aan te pakken, hebben we gebruik gemaakt van een gemodificeerde stroom clamp techniek, dynamische klem, ook wel geleiding klem 1, 2, 3 en onderzocht de impact van de prikkelende en remmende synaptische inputs op de neuronale prikkelbaarheid. Deze techniek vereist de injectie van stroom in de cel en is afhankelijk van de real-time feedback van de membraanpotentiaal op dat moment. De injected stroom wordt berekend op basis van vooraf bepaalde prikkelende en remmende synaptische conductances, hun omkering potentieel en ogenblikkelijke membraanpotentiaal van de cel. Details over de experimentele procedures, worden patch klemmen cellen om een whole-cell configuratie en de werkgelegenheid van de dynamische clamp techniek bereiken geïllustreerd in deze video artikel. Hier tonen we de responsen van muizen retinale ganglioncellen verschillende geleiding golfvormen verkregen fysiologische experimenten controle omstandigheden of de aanwezigheid van drugs. Verder tonen we het gebruik van kunstmatige prikkelende en remmende geleidingen gegenereerd middels alpha functies om de reacties van de cellen te onderzoeken.
Introduction
Het netvlies is een bijna transparante neuraal weefsel langs de achterkant van het oog. Veel studies gebruiken het netvlies als het model om de eerste stappen in de verwerking van visuele en mechanismen van synaptische signalering te onderzoeken. Aangezien de retinale netwerk van het-mount preparaat intact blijft na sectie, vormt dit een ideaal systeem synaptische interacties te bestuderen als fysiologische reacties zijn vergelijkbaar met de in vivo omstandigheden. Dus, met behulp van een geïsoleerde retina de eigenschappen van zijn neuronen kunnen worden bestudeerd met behulp van patch clamp technieken (voor reviews over de techniek, zie 6,9,13). Identificatie van de precieze bijdrage van specifieke circuits en neurotransmitters ganglion cel respons echter meestal belemmerd als farmacologische middelen werken op verschillende sites.
Fysiologische reacties van retinale neuronen aan het licht, de natuurlijke stimulus, kan worden opgenomen met glazen pipetten gevuld met intracellulaire vloeistof. Met behulp van patch clamp technieken, neuronale reacties op licht stimulatie kan worden opgenomen als membraanpotentiaal fluctuaties (stroomtang) of als stromingen (voltage clamp). Door die de membraanpotentiaal op verschillende voltages en uitvoering a posteriori geleiding analyse is het mogelijk remmende en prikkelende synaptische inputs isoleren 5,12. Dit soort experimenten worden uitgevoerd in normale baden medium en in de aanwezigheid van verschillende farmacologische middelen om de bijdrage van verschillende neurotransmitters en receptoren neuronale reacties isoleren. Een schat aan studies van vele laboratoria gekarakteriseerd de afhankelijkheid van stekelige output en prikkelende en remmende ingangen op stimulus eigenschappen zoals grootte, contrast, ruimtelijke en temporele frequenties, richting, oriëntatie en andere stimulus variabelen. Hoewel deze experimentele benaderingen geven informatie over de relatie tussen de spike output en synaptische inputs als functie van stimulus eigenschappen,interpretatie van de bijdrage van specifieke celtypen en hun synaptische inputs naar cel exciteerbaarheid niet eenvoudig. Dit komt door het feit dat zowel typische prikkelende en remmende inputs variëren stimulus eigenschappen en dus is het niet mogelijk om het precieze effect dat veranderingen in een van deze parameters moet op neuronale spiking beoordelen.
Een alternatieve benadering om deze beperkingen te omzeilen is voor het uitvoeren van dynamische clamp opnames, die een kritische evaluatie van de bijdrage van de individuele synaptische inputs naar stekelige uitgang toestaan. De dynamische clamp techniek maakt directe injectie van stroom in de cel en de hoeveelheid stroom geïnjecteerd in een bepaald afhankelijk van de opgenomen membraanpotentiaal destijds 1,2,3 (zie voor 7,14). Het is een gemodificeerde stroomklem set-up waarbij een real-time, snelle feedback interactie tussen de cel onder opname en de apparatuur bestaande uit gespecialiseerde hardware, softwareen een computer bereikt. De hoeveelheid stroom geïnjecteerd in de cel wordt dienovereenkomstig berekend. Vandaar dat het voordeel van deze methode is dat de cellen kunnen worden gestimuleerd met verschillende combinaties geleidingstijd golfvormen en de reactie zal de activatie van receptoren die synaptische inputs bemiddelen nabootsen. Bijvoorbeeld, vergelijking van de reactie op injectie van prikkelende en remmende geleidingen voor een kleine vlek met de reactie op injectie van prikkelende geleiding voor een kleine vlek alleen informatie over het effect van remming op de celrespons. Ook andere combinaties van fysiologisch opgenomen conductances collocatie kan worden geïnjecteerd om te onthullen hoe stimulus-afhankelijke veranderingen in prikkelende en / of remmende conductances invloed spike output.
In onze studie is de dynamische clamp techniek gebruikt om het effect van de relatieve amplitude en tijdstip van synaptische inputs op de vuurgedrag van retinale ganglion cellen vertonen. Diverse conductantiesverkregen fysiologische experimenten controle omstandigheden of in aanwezigheid van farmacologische middelen werden gebruikt als input. Daarnaast zijn kunstmatige geleidingen gebaseerd op alpha functies ook gebruikt om te onderzoeken hoe synaptische inputs worden geïntegreerd door neuronen. Dit is dus een veelzijdige techniek die het mogelijk maakt verschillende soorten geleiding gegenereerd ofwel fysiologisch, farmacologisch of rekenkundig worden geïnjecteerd in dezelfde ganglion cel, zodat de respons op deze ingangen worden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier tonen we gebruik van dynamische klem om de invloed van de verhouding en de relatieve timing van excitatie en inhibitie van retinale ganglioncellen uitgang beoordelen. Dynamische klem wordt gebruik gemaakt van computersimulaties om fysiologisch opgenomen of kunstmatige synaptische conductances introduceren in levende neuronen. Deze methode biedt een interactief instrument waarmee geleidingen kunnen worden gemodificeerd en geïnjecteerd in neuronen voor het berekenen van hun invloed op neuronale reacties. Conductanti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de Australische Research Council (ARC DP0988227) en de Biomedische Wetenschappen Research Initiative Grant van de Discipline van de Biomedische Wetenschappen, de Universiteit van Sydney. De apparatuur Patch Clamp Amplifier EPC 8 werd gefinancierd door het Fonds Startup van de Discipline van de Biomedische Wetenschappen, de Universiteit van Sydney. De apparatuur InstruTECH LIH 8 8 Data Acquisition System werd gekocht met het geld van Rebecca L. Kuiper Foundation en Startup Fund van de Discipline van de Biomedische Wetenschappen, de Universiteit van Sydney. We zouden graag de anonieme reviewers bedanken voor hun inzichtelijke suggesties en opmerkingen.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Microelectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith & Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation |
References
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -. S. . Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).
- Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
