Vi beskriver en encellig hög genomströmning analys för att mäta cytotoxicitet hos T-celler när de inkuberas med tumörmålceller. Denna metod använder en tät, elastomer matris av sub-nanoliter brunnar (~ 100.000 brunnar / grupp) att rumsligt begränsa de T-celler och målceller vid definierade förhållanden och är kopplad till fluorescensmikroskopi för att övervaka effektor-mål konjugering och efterföljande apoptos.
Cancer immunterapi kan utnyttja specificitet immunsvaret att rikta och eliminera tumörer. Adoptiv cellterapi (ACT) baserat på adoptiv överföring av T-celler genetiskt modifierade för att uttrycka en chimär antigenreceptor (CAR) har visat mycket lovande i kliniska prövningar 1-4. Det finns flera fördelar med att använda CAR + T-celler för behandling av cancer, inklusive förmågan att rikta icke-MHC begränsade antigener och att funktionalisera de T-celler för optimal överlevnad, målsökande och uthållighet i värden, och slutligen för att inducera apoptos av CAR + T-celler i händelse av värdtoxicitet 5.
Avgränsar de optimala funktioner CAR + T-celler associerade med klinisk nytta är avgörande för utformningen av nästa generation av kliniska prövningar. Senaste framstegen inom levande djur avbildning som multiphoton mikroskopi har revolutionerat studiet av immunceller funktion iN in vivo 6,7. Även om dessa studier har avancerat vår förståelse av T-cellfunktioner in vivo, T-cell baserad ACT i kliniska prövningar kräver att behovet av att koppla molekylära och funktionella egenskaper hos T-cell preparat före infusion med klinisk effekt efter infusionen, genom att utnyttja i vitro-analyser övervakning T-cellfunktioner som, cytotoxicitet och cytokin sekretion. Standard flödescytometri baserade analyser har utvecklats som bestämmer den övergripande funktion av populationer av T-celler vid encelliga nivå men dessa är inte lämpliga för övervakning av konjugat-bildning och livslängd eller förmågan hos samma cell för att döda flera mål 8.
Mikrofabricerade matriser utformade i biokompatibla polymerer som polydimetylsiloxan (PDMS) är en särskilt attraktiv metod för att rumsligt begränsa effektorer och mål i små volymer 9. I kombination med automatiserad time-lapse fluorescensmikroskopi, thousands av effektor-mål interaktioner kan övervakas samtidigt av avbildning enskilda brunnar i en nanowell array. Vi presenterar här en hög genomströmning metod för övervakning av T-celler förmedlad cytotoxicitet vid encelliga nivå som kan tillämpas i stor utsträckning för att studera den cytolytiska funktionaliteten av T-celler.
Vi har beskrivit protokollet för en hög genomströmning encelliga cytolytisk analys aktiveras via samtidig inkubation av effektorer och mål i grupper av nanowells (Figur 1). Förutom genomströmning en stor fördel med tekniken är möjligheten att övervaka effektor-medierad cytotoxicitet mot önskade målceller utan behov av målcellen teknik som i sin tur möjliggör användning av autologa eller matchade / primär tumörceller som målceller. Den rumsliga inneslutning tillåter hämtning och efte…
The authors have nothing to disclose.
Forskningen redovisas i denna publikation stöddes av National Cancer Institute i National Institutes of Health i Award nummer R01CA174385. Innehållet är endast ansvar författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
Dulbecco’s PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |