Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen
Summary
We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.
Abstract
Immunotherapie van kanker kunnen benutten van de specificiteit van immuunrespons op te richten en te elimineren tumoren. Adoptieve celtherapie (ACT) gebaseerd op de adoptieve overdracht van T-cellen genetisch gemodificeerd om een chimeer antigen receptor (CAR) expressie blijkt aanzienlijke belofte in klinische proeven 1-4. Er zijn verscheidene voordelen aan het gebruik CAR + T cellen voor de behandeling van kanker inclusief de mogelijkheid om niet-MHC beperkte antigenen te richten en de T-cellen voor optimale overleving, homing en persistentie in de gastheer functionaliseren en uiteindelijk apoptose induceren van CAR + T-cellen bij ontvangst toxiciteit 5.
Afbakening van de optimale functies van CAR + T cellen geassocieerd met klinische voordelen zijn essentieel voor het ontwerpen van de volgende generatie klinische trials. Recente ontwikkelingen in levende dieren imaging zoals multifoton microscopie hebben een revolutie in de studie van de immuun cel functie in 6,7 vivo. Hoewel deze studies hebben ons begrip van T-cel functie in vivo, T-cel-gebaseerde ACT in klinische proeven vereist de noodzaak moleculaire en functionele kenmerken van T-cel preparaten koppelen pre-infusie met klinische werkzaamheid na de injectie door gebruik in vitro testen bewaken T-cel functies zoals, cytotoxiciteit en cytokine secretie. Flow-cytometrie standaard gebaseerde testen ontwikkeld die bepalen de algemene werking van populaties van T-cellen in de eencellige niveau, maar deze zijn niet geschikt voor het bewaken conjugaat vorming en levens of het vermogen van dezelfde cel te doden meerdere doelen 8.
Microfabricated arrays ontworpen biocompatibele polymeren zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) een bijzonder aantrekkelijke methode om ruimtelijk beperken effectoren en targets in kleine volumes 9. In combinatie met automatische time-lapse fluorescentiemicroscopie, thousands van effector-target interacties gelijktijdig monitoren door beeldvorming afzonderlijke putjes van een nanowell array. We stellen hier een high-throughput methode daartoe T-cel gemedieerde cytotoxiciteit bij de eencellige niveau breed toepasbaar voor onderzoek naar de functies van cytolytische T-cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben geschetste protocol voor een high-throughput eencellige cytolytische assay geactiveerd door co-incubatie van effectors en doelen in arrays van nanowells (figuur 1). Naast throughput een belangrijk voordeel van de techniek is de mogelijkheid om effector-gemedieerde cytotoxiciteit tegen gewenste doelcellen volgen zonder doelcel techniek wat op zijn beurt het gebruik van autologe of matched / primaire tumorcellen als doelcellen. De ruimtelijke opsluiting maakt het ophalen en daaropvolgende kloner…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd gesteund door de National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award Aantal R01CA174385. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco’s PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
- Louis, C. U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 118, 6050-6056 (2011).
- Savoldo, B., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. , (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).
- Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
- Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).
- Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).
- Makedonas, G., Betts, M. R. Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV. Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).
- Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).
