Vi beskriver en enkelt-celle high-throughput assay til måling af cytotoksicitet af T-celler, når inkuberet med tumormålceller. Denne fremgangsmåde anvender en tæt, elastomere matrix af sub-nanoliter brønde (~ 100.000 brønde / række) til rumligt begrænse de T-celler og målceller ved definerede forhold og er koblet til fluorescensmikroskopi for at overvåge effektor-mål-konjugation og efterfølgende apoptose.
Kræft immunterapi kan udnytte specificiteten af immunrespons til at målrette og fjerne tumorer. Adoptiv celleterapi (ACT) baseret på den adoptive overførsel af T-celler genmodificerede til at udtrykke et kimært antigen receptor (CAR) har vist betydelig lovende i kliniske forsøg 1-4. Der er flere fordele ved at bruge CAR + T-celler til behandling af cancere, herunder evnen til at målrette ikke-MHC-begrænsede antigener og at funktionalisere T-cellerne for optimal overlevelse, homing og vedholdenhed i værten, og endelig at inducere apoptose af CAR + T-celler i tilfælde af værtsorganismens toksicitet 5.
Afgrænse de optimale funktioner CAR + T-celler, der er forbundet med klinisk fordel er afgørende for tilrettelæggelsen af den næste generation af kliniske forsøg. Nylige fremskridt inden for levende dyr billedbehandling som multiphoton mikroskopi har revolutioneret studiet af immun celle funktion in vivo 6,7. Mens disse studier har fremmet vores forståelse af T-cellefunktioner in vivo, T-celle-baserede ACT i kliniske forsøg kræver, at det er nødvendigt at forbinde molekylære og funktionelle egenskaber af T-cellepræparater præ-infusion med klinisk effektivitet efter infusion, ved anvendelse i vitro assays overvågning T-cellefunktioner lignende, cytotoksicitet og cytokinsekretion. Standard flow-cytometri assays er blevet udviklet, at bestemme den overordnede funktion af populationer af T-celler på enkeltcelle-niveau, men disse er ikke egnet til overvågning af konjugatdannelse og levetid eller mulighed for den samme celle at dræbe flere mål 8.
Microfabricated arrays designet i biokompatible polymerer, såsom polydimethylsiloxan (PDMS) er en særdeles attraktiv metode til rumligt begrænse effektorer og mål i små volumener 9. I kombination med automatiseret time-lapse fluorescensmikroskopi, thousands af effektor-mål-interaktioner kan overvåges samtidigt af billeddannende individuelle brønde i en nanowell array. Vi præsenterer her en high-throughput metode til overvågning af T-cellemedieret cytotoksicitet på enkeltcelle-niveau, der stort set anvendes til at studere den cytolytiske funktion af T-celler.
Vi har skitseret protokollen for en high-throughput encellede cytolytisk assay aktiveret via co-inkubation af effektorer og mål i arrays af nanowells (figur 1). Ud over gennemløb en væsentlig fordel ved teknikken er evnen til at overvåge effektor-medieret cytotoksicitet mod ønskede målceller uden behov for målcellen teknik som igen tillader anvendelse af autologe eller matched / primære tumorceller som målceller. Den rumlige indeslutning tillader hentning og efterfølgende kloning af funktionel…
The authors have nothing to disclose.
Forskningen rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health under Award Number R01CA174385. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
Dulbecco’s PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |