Summary

מדידות נכונות חדרית סיסטולי לחץ בשילוב עם קציר של ריאה ודגימות רקמה חיסוניות בעכברים

Published: January 16, 2013
doi:

Summary

פרוטוקול ספציפי ומהיר במקביל לחקירת פונקציה נכונה לב, דלקת ריאות, והתגובה החיסונית מתואר ככלי למידה. וידאו ודמויות מתארים פיזיולוגיה וטכניקות microdissection בצוות גישה מאורגנת שניתנת להתאמה לשימוש לקטן למחקרים בגודל גדולים.

Abstract

תפקוד הלב הנכון הוא להזרים דם דרך הריאות, ובכך מקשר פיזיולוגית לב ימנית ופיזיולוגיה של כלי דם ריאתי. דלקת היא צירוף שכיח של תפקוד לב וריאות, על ידי חדירה לפרט סלולרית, ייצור ציטוקינים וגורמי גדילה, ועל ידי ייזום תהליכי שיפוץ 1.

בהשוואה לחדר השמאלי, חדר ימין הוא משאבה בלחץ נמוך הפועלת באזור צר יחסי של שינויים בלחץ. לחצי עורק ריאה מוגברת קשורים ללחץ מוגבר במיטת כלי דם הריאה ויתר לחץ דם ריאתי 2. יתר לחץ דם ריאה קשור לעתים קרובות עם מחלות דלקתיות ריאה, למשל מחלת ריאות חסימתית כרונית, או מחלות אוטואימוניות 3. בגלל יתר לחץ דם ריאה מעניק פרוגנוזה גרועה לאיכות חיים ותוחלת חיים, הרבה מחקר מכוון להבנת המנגנונים שהמיגHT להיות מטרות להתערבות 4 תרופות. האתגר העיקרי לפיתוח של כלים לניהול יעילים עבור יתר לחץ דם ריאתי נשאר את המורכבות של ההבנה סימולטנית של שינויים מולקולריים ותאיים בלב הימני, ריאות ולמערכת החיסונית.

כאן, אנו מציגים את זרימת פרוצדורליים למדידה המהירה ומדויקת של שינויים בלחץ בלב הימני של עכברים וקציר סימולטני של דגימות מלב, ריאות ורקמות חיסוניות. השיטה מבוססת על הצנתור הישיר של חדר ממני דרך וריד הצוואר בעכברים קרובים חזה, פותח לראשונה בסוף 1990 כמדד חלופי של לחצים בעורק הריאה 5-13. צוות הגישה המאורגנת מאפשרת טכניקת צנתור מהירה מאוד נכונה לב. זה מאפשר לבצע את המדידות בעכברים כי באופן ספונטני לנשום אוויר חדר. הארגון של זרימת העבודה באזורי עבודה שונים-מפחית את השהיית זמן ופותח את האפשרות במקביל לביצוע ניסויי פיזיולוגיה וקציר רקמות חיסוניים, לב וריאות.

זרימת פרוצדורליים המתוארים כאן ניתן להתאים למגוון רחב של הגדרות במעבדה ועיצובי לימוד, מניסויים קטנים וממוקדים, למבחני מיון תרופות גדולים. הרכישה סימולטני של נתוני פיזיולוגית לב כי ניתן להרחיב לכלול אקו 5,14-17 וקציר של רקמות לב, ריאה וחיסון מפחיתה את מספר בעלי החיים הדרושים כדי להשיג נתונים שנעים בבסיס הידע המדעי קדימה. זרימת פרוצדורליים מוצגת כאן גם מספקת בסיס אידיאלי לרכישת ידע מהרשתות שהקישור, ריאות חיסוניות ותפקוד לב. את אותם עקרונות שהתוו כאן ניתן להתאים ללמוד איברים אחרים או נוספים במידת צורך.

Protocol

1. הכנה הכן את הפתרונים הבאים ואבובים (לוח 1), כדלקמן: הנקס פתרון, לא סידן, מגנזיום או חיווי עם פניצילין (100 U / ml) / סטרפטומיצין (100 מ"ג / מ"ל). <li style=";text-align:right;dir…

Representative Results

התוצאה העיקרית להשגת עקומות לחץ לב ימניות מושגת על ידי המיקום הנכון של צנתר הלב הימני. הצורה של העקומות בזמן לחץ היא קריטית, כי המיקום הנכון של הצנתר בתוך של חדר ממני יגרום מישורי לחץ (איור 4). קימורים מחודדים, במקום, מצביעים קטטר שמועבר על ידי הנשימה או תנועת פ…

Discussion

הזרימה הניסויית המתוארת כאן מאפשרת מדידה מהירה וסימולטני של לחץ הנכון חדרית סיסטולי וקציר של דגימות לניתוח התשובות בריאות, לב והמערכת החיסונית בעכברים. ההליך משלב מדידות לב פיזיולוגיה, מייקרו נתיחה וקציר רקמה הבאה ללימודים חיים תא, ניתוח היסטולוגית או omics-ניתוח של ה…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות 1R21HL092370-01 (ג"ג), 1R01 HL095764-01 (ג"ג); R01HL082694 (ג"ו); איגוד לב אמריקאי, שותפי מייסדים (0855943D, ג"ג); סטוני ולד – הרברט קרן, ניו יורק (SHP).

Materials

Name Company Catalogue number Comments (optional)
Reagents
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463
2,2,2-Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402
disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) Fisher Scientific 1629-08
Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade PHARMCO-AAPER 111000200 Dilute to 70 % with distilled water
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635-500ML Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water
Hanks solution, no calcium, magnesium Fisher Scientific 21-022-CV
O.C.T Tissue-Tek 4583
Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution Thermo Scientific SV30010
Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions Fisher Scientific
Sodium pentobarbital 26% Fort Dodge Animal Health NDC 0856-0471-01
Labware
Plates 12, 24, 96 well Falcon
Transfer Pipet Fisher Scientific 13-711-9BM
Tube, EDTA coated Sarstedt 2013-08
Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge VWR
Tubes 12 x 75 mm polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D
Tubes, various sizes, polypropylene Fisher Scientific
Instruments
Forceps, Dumon #5 Fine Fine Science Tools 11254-20
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved Fine Science Tools 11152-10
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight Fine Science Tools 11150-10
Cannula 18 ga, 19 ga BD Precision Glide Needles Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface.
Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm Fine Science Tools 14081-09
Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 Fine Science Tools SP116
Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 Teleflex medical 18020-60
Syringe, 1 ml BD 309659
Equipment
Amplifier, PowerLab 4/30 ADInstrument Model ML866
Catheter, pressure F1.4 Millar Instruments, Inc 840-6719
Dissecting Microscope Variscope
Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades Fine Science Tools 15000-00
Halogen Illuminated Desk Magnifier Fisher Scientific 11-990-56
Laptop computer Asus Model number A52F i5 processor; 15 inch
Light Source Amscope HL-250-A
Pressure Control Unit Millar Instruments, Inc PCU-2000
Software, Labchart-Pro V.7 AD Instruments

References

  1. Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
  2. Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
  3. Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
  4. Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
  5. Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
  6. Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
  7. Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
  8. West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
  9. Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
  10. West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
  11. Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
  12. Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
  13. Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
  14. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
  15. Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
  16. Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
  17. Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
  18. Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
  19. Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
  20. Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
  21. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
  22. Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
  23. Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
  24. Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
  25. Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
  26. Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).
  27. Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
  28. Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
  29. Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).

Play Video

Citer Cet Article
Chen, W., Park, S., Hoffman, C., Philip, C., Robinson, L., West, J., Grunig, G. Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice. J. Vis. Exp. (71), e50023, doi:10.3791/50023 (2013).

View Video