Summary

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em> Drosophila</em> 망막

Published: November 14, 2012
doi:

Summary

<em> Drosophila</em> 망막은 틀에 박힌 방식으로 생성 된 세포 유형의 소수로 구성된 크리스탈과 같은 격자입니다<sup> 1</sup>. 정교한 유전자 분석에의 복종 할 의무는 복잡한 개발 프로그램의 연구를 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 photoreceptor 차별화를 중심으로 세 이산 발달 단계에서 dissections와 망막의 immunohistochemistry에 대해 설명합니다.

Abstract

Drosophila melanogaster의 화합물 눈은 약 750 ommatidia (단위 눈)으로 구성되어 있습니다. 각 ommatidium는 렌즈 분비 콘 세포, 안료 세포, 억센 털 셀 및 8 photoreceptors (푸에르토 리코 놈들) R1-R8이 포함 약 20 세포로 구성되어 있습니다. 푸에르토 리코 놈들은 빛에 민감한 안료, Rhodopsins을 (RHS)를 포함 전문 microvillar 구조, rhabdomeres을 수 있습니다. 여섯 푸에르토 리코 놈들의 rhabdomeres (R1-R6)는 사다리꼴을 형성하고 Rh1 3 4이 포함되어 있습니다. R7 및 R8의 rhabdomeres는 사다리꼴의 중심에 직렬로 위치와 빛의 동일한 경로를 공유 할 수 있습니다. R7 및 R8 푸에르토 리코 놈들은 stochastically 두 가지 하위 유형 5 RHS의 다른 조합을 표현 : 'P'하위 유형에서, P R7s의 Rh3는 P R8s에 Rh5와 결합되어, 'Y'하위 유형에 Y R7s의 Rh4이 연관된 반면, Y의 Rh6는 6 7 8 R8s.

푸에르토 리코 놈들과 ommatidia 개발의 초기 사양은 애벌레의 눈 antennal imaginal 디스크, 상피 세포의 monolayer에서 시작됩니다. 차별화의 파도가 디스크 9에서 쓸어과 ommatidia 10-11로 undifferentiated 세포의 조립을 시작합니다. '설립자 셀'R8 먼저 지정하고 R7 12-14 R1-6 그리고 모집합니다.합니다 그 후, pupal 개발하는 동안, 홍보 차별화 rhabdomere 형성, synaptogenesis 결국 RH 표현을 포함한 다양한 형태학의 변화 15로 연결됩니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 망막 형성과 발달 경로에 관한 질문의 다양한 해결하기 위해 적용 할 수있는 망막 개발의 세 정의 된 기간에서 망막 dissections 및 immunohistochemistry하는 방법을 설명합니다. 여기, 우리는 전체 마운트 애벌레의, midpupal 및 성인 망막 (의 단일 셀 레벨에서 stepwise PR 차별화를 시각적으로 이러한 방법을 사용 <s> 그림 1) trong.

Protocol

1. 소개 세 번째 instar 애벌레의, midpupal과 성인 무대 :이 동영상에서는, 우리는 세 가지 정의 개발 기간의 망막 dissections 및 immunohistochemistry하는 방법을 설명합니다. 우리 프로토콜 다른 pupal 단계 (초기 단계에 대한 자세한 내용은, 16 참조)를 위해 일이지만 하나의 초점 평면과 핵의 모든 푸에르토 리코 놈들이의 시각화을 용이하게하는, 쉽게 식별 할 수있는 이미지에 적?…

Discussion

1. 문제 해결

우리의 경험에서 dissections가 연습 (최대 몇 주까지)이 필요하고 테이블에 팔꿈치와 팔을 쉴 의해 손가락 분해 요리와 접촉을 갖춘 편안한 손의 위치 21 달성에 의해 촉진된다. 이렇게 만 엄지 손가락, 색인 및 중간 손가락이 미묘한 움직임을 수행합니다.

photoreceptors를 손상시키지 않고 얇은 판을 제거하면 아마도 가장 어려운 단계입니?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 HY에 Ehrman의 교제에 의해 지원되었다. H., DV, JR에 뉴욕 대학교 학장의 학위 논문 CD에 DJ로 휄로 십, NIH GrantR01 EY13010 및 DFG 교제에 RJJ, NIH 그랜트 F32EY016309에 의학 연구 박사 친목을위한 제인 코핀 일즈 기념 기금 (RI 2208/1- 1). 우리는 원고에 대한 의견 니나 Vogt와 파멜라 Boodram 감사드립니다.

Materials

Reagent
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) Sigma Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections.
Triton-X 100 Sigma 9002-93-1 Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature.
37% formaldehyde solution Fisher Scientific F75P1GAL Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice.
5% normal horse serum Jackson Immuno Research 008-000-001 Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees.
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) Invitrogen Molecular Probes A11015
A31572
A31571
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees.
Alexa Fluor 488 Phalloidin A12379 Dilute 1:100 in secondary antibody solution.
Slowfade Gold Antifade reagent Invitrogen Molecular Probes S36936 Mounting medium. Store at -20 degrees.
Glycerol Fisher Scientific G31-1 For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp.
CO2 For anesthetizing adult flies.
Equipment
Two sharp forceps (Dumont #55) Fine Science Tools 11255-20
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture.
Three-well glass dissection dishes Fisher Scientific 21-379
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) Fine Science tools 26002-10 Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook.
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) Fisher Scientific 12-542A
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) Fisher Scientific 12-550-143
1.5 ml microcentrifuge tubes
Clear nail polish or Scotch tape
Orbital shaker Bellco
Slide holder box Fisher Scientific
Parafilm Bemis PM996
Thin paintbrush
P20 and P200 micropipettes and tips
Dissecting microscope
Small bucket with ice For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions.

References

  1. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
  2. Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).
  3. O’Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
  4. Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
  5. Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
  6. Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
  7. Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
  8. Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
  9. Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
  10. Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
  11. Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
  12. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
  13. Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
  14. Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
  15. Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
  16. Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
  17. Wolff, T., Sullivan, W. e. a. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. , (2000).
  18. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
  21. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
  22. Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Génétique. 152, 1631-1639 (1999).
  23. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
  24. Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
  25. Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
  26. Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
  27. Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
  28. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).

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Citer Cet Article
Hsiao, H., Johnston Jr., R. J., Jukam, D., Vasiliauskas, D., Desplan, C., Rister, J. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. J. Vis. Exp. (69), e4347, doi:10.3791/4347 (2012).

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