ザ<em>ショウジョウバエ</em>網膜は、紋切り型の方法で生成された細胞の種類の数が少ないからなる結晶状格子です<sup> 1</sup>。洗練された遺伝解析への従順は、複雑な発達プログラムの研究を可能にします。このプロトコルは、感光体の分化を中心に、3つの個別の発達段階で解剖し、網膜の免疫組織化学を説明しています。
キイロショウジョウバエの複眼は約750 ommatidiumの複数形(ユニット目)から構成されています。それぞれの個眼は、レンズを分泌する錐体細胞、色素細胞、毛細胞と8つの光受容体(PRS)R1〜R8 2を含む約20の細胞で構成されています。 PRSは、特殊な微絨毛構造、光に敏感な顔料を含有rhabdomeres、ロドプシンを(RHS)があります。 6 PRのrhabdomeres(R1〜R6)は、台形を形成し、体Rh1 3 4が含まれています。 R7とR8のrhabdomeresは台形の中心にタンデムに配置され、光の同じパスを共有しています。 R7とR8 PRSは確率的に2メインサブタイプ5のRHSのさまざまな組み合わせを表現: 'p'のサブタイプでは、p R7sでRH3 は p R8sでRH5と結合されて、 'y'のサブタイプには、y R7sでRH4が関連付けられているのに対し、 yの R8sでRH6 6 7 8。
PRSとommatidiumの複数形の開発の初期仕様では幼虫の目触角成虫原基は、上皮細胞の単層で始まる。差別化の波は、ディスク9に掃引とommatidiumの複数形10月11日に未分化細胞のアセンブリを開始します。 '創始細胞' R8はR7を12月14日 、第1及び新入社員、R1-6と指定されています。その後、蛹の開発中に、PRの分化は感桿分体形成、シナプス形成し、最終的にrhの発現を含む広範な形態学的変化15につながる。
このプロトコルでは、網膜の形成や発達経路に関するさまざまな問題に取り組むために適用することができる網膜の開発の3つの定義された期間、網膜における解剖および免疫組織化学のための方法を説明します。ここで、我々は全体のマウント幼虫、midpupalと成人網膜の単一細胞レベルで段階的なPRの分化を視覚化するために、これらのメソッドを使用します( <sチョン·>図1)。
1。トラブルシューティング
我々の経験では、解剖の練習(最大〜数週間)が必要で、テーブルの上に、解剖皿に接触して指で肘や前腕を置くことによって快適な手の位置21を達成することによって促進される。そのように、唯一の親指、人差し指と中指が微妙な動きを実行します。
感光体を傷つけることなく薄層を除去することは、?…
The authors have nothing to disclose.
この作品はHYにEhrmanの交わりによってサポートされていました。 H.、DV、JRにニューヨーク大学ディーンの論文をCDにDJのフェローシップは、NIH GrantR01 EY13010とDFG交わりRJJ、NIHグラントF32EY016309に医学研究ポスドクのためのジェーン棺チャイルズメモリアル基金(RI 2208/1- 1)。我々は、原稿上のコメントのためのニーナ·フォークトとパメラBoodramに感謝します。
Reagent | |||
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
Equipment | |||
Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
Clear nail polish or Scotch tape | |||
Orbital shaker | Bellco | ||
Slide holder box | Fisher Scientific | ||
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Thin paintbrush | |||
P20 and P200 micropipettes and tips | |||
Dissecting microscope | |||
Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |