قياس تأثيرات على الأجسام المضادة من وظيفة الخلوية Cardiomyocytes متفرقة

1. مفتش عزل من عينات المرضى

1. إعداد ميني امتزاز مناعي عن طريق ملء الأعمدة 3 مل المضادة للمفتش sepharose و في 2 مل EDTA المريض البلازما في عمود فارغ باك فندق Econo. مفتش العزلة يتطلب على الأقل 2 مل من البلازما المريض.
2. وضع مرشح على رأس sepharose و المضادة للمفتش، وقطع فتح انخفاض غيض من العمود ثم اضغط على مرشح ليصل الى معدل تدفق ما يقرب من 1 قطرة / ثانية. اسمحوا الحل الحفاظ نفاد العمود.
3. غسل العمود مع 3 مجلدات 0.9٪ كلوريد الصوديوم في حجم البلازما.
4. ماصة البلازما على العمود. عندما البلازما ومغمورة تماما في sepharose و المضادة للمفتش، وغسل مع وحدة التخزين نفسها كلوريد الصوديوم 0.9٪.
5. ماصة حجم البلازما واحد من حمض الهيدروكلوريك 0.2 M جليكاين، ودرجة الحموضة 2.8 على العمود والسماح تزج في sepharose و. إضافة وحدة تخزين أخرى من حمض الهيدروكلوريك جليكاين على العمود. جمع من خلال تدفق في أنبوب 15 مل وضبط درجة الحموضة إلى 7.3 مع 0.5 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0.
6. لتجديد العمود، وغسل حمض الهيدروكلوريك مع 3 بلازما جليكاين مجلدات. بعد غسل النهائي مع 2 مجلدات 0.9٪ كلوريد الصوديوم، يمكن استخدام عمود للعينة البلازما المقبل. وبدلا من ذلك، يمكن ملء العمود مع الحفاظ الحل وتخزينها في 4 - 8 ° C لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
7. للاستخدام على cardiomyocytes، الكسر مفتش جمعها لابد من مدال ضد العازلة التجريبية (EB). لإعداد EB، إضافة كلوريد الصوديوم 117 ملم، 2.8 ملي بوكل، 0.6 ملم MgCl _2، 1.2 مم KH ₂ PO _4، 1.2 مم CaCl _2، HEPES 10 و 20 ملي ملي الجلوكوز في الماء المقطر L 1 على النمام المغناطيسي وضبط درجة الحموضة إلى 7.3.
8. ملء جزء مفتش لأنبوب استر السليلوز غشاء غسيل الكلى مع الوزن الجزيئي قطع من 100 كيلو دالتون. وضع أنبوب في EB L 1 ويحرك ببطء مع النمام المغناطيسي عند 4 ° C. بعد 8 ساعات، نقل أنبوب غسيل الكلى في 3 L من EB الطازجة وdialyze لمدة ساعة 20 في 4 درجات مئوية.
9. بعد غسيل الكلى، والحرارة العينة لمدة 30 دقيقة عند 57 درجة مئوية في حمام مائي لinactivatعوامل مكملة ه. تحديد إجمالي مفتش التركيز وإعداد مأخوذة تحتوي على 330 ميكروغرام لكل مفتش. عند إضافة العينة لcardiomyocytes لقياس (الخطوة 4.3)، تملأ مأخوذة إلى 1 مل مع EB. ويمكن تخزين مأخوذة غير مخفف في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

2. عزل Cardiomyocytes الجرذ

1. لإعداد كا ^{2 +} خالية من العزلة عازلة (IB)، إضافة 110 مم كلوريد الصوديوم، 2.6 ملي بوكل، 1.2 ملي MgSO _4، 1.2 مم KH ₂ PO _4، HEPES 20 ملي مول و 11 ملم إلى الجلوكوز المياه L 1 المقطر باستخدام المغناطيسي النمام. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 في درجة حرارة الغرفة وفلتر من خلال مرشح ميكرون 0،2 الأعلى للزجاجة التعقيم.
2. ملء 80 مل من IB في الخزان العلوي من نظام Langendorff نضح thermostated. ضبط إعدادات الحرارة للحفاظ على درجة الحرارة عازلة للC ° 37 وتهوية العازلة مع O٪ 95 _2/5٪ CO ₂ لمدة 30 دقيقة.
3. تزن ما يقرب من 10،000 - 12،000 من U collagenase نوع II، 175 ملغ حمض الدهنية الحرة وحل BSA في 20 مل تحتوي على 22،5 IB ميكرولتر من حل من 100 ملي CaCl الأسهم _2. السيطرة على درجة الحموضة عازلة للعزلة في الخزان العلوي وتعديل إذا لزم الأمر.
4. تخدير الفئران ويستار من 175 حتي 200 غ مع 375 ميكروغرام / كغ وزن الجسم ثيوبنتال. إضافة إلى 2500 وحدة دولية الهيبارين حل ثيوبنتال. بعد بضع الصدر والقلب والمكوس بعناية مع قوس الأبهر سليمة وتحويلها إلى ثلج الباردة كلوريد الصوديوم 0.9٪. تنظيف القلب من الدم والأنسجة المحيطة بها ونقلها لكلوريد الصوديوم النقي بنسبة 0.9٪. فضح الشريان الأورطي، فتح المخفض تدفق النظام Langendorff للحصول على سرعة إسقاط 2-3/sec وإرفاق القلب إلى قنية.
5. يروي قلب لمدة تصل إلى 3 دقائق مع معدل التدفق من 1 قطرة / ثانية لتغسل الدم المتبقية. بدء تعميم IB في النظام Langendorff. إزالة 20 مل العازلة من الخزان العلوي، وملء في حل كولاجيناز والملء وحاجز بكثير كما هو مطلوب ليصل إلى 80 ملم. تعميم ج حل آخر لollagenase دقيقة 27. يجب السيطرة على معدل التدفق بشكل دوري والحفاظ عليها في 1 قطرة / ثانية باستخدام المخفض التدفق.
6. فصل القلب من قنية ونظيفة من الأذينين والشريان الأورطي وختم الى قطع صغيرة. يسمح الحل كولاجيناز لتشغيل في أقل الخزان، والحد من حجم إلى حد أقصى قدره 40 مل وهضم المزيد من البطينين المفروم لمدة 10 - 15 دقيقة تحت تهوية مستمرة مع 95٪ O _2/5٪ CO _2. بعد ذلك، تصفية التعليق الخلية من خلال الشاش ميكرومتر 200 حجم فتحات الشباك في أنبوب 50 مل.
7. استعادة محتوى الكالسيوم ^{+ 2} من الخلايا في 3 خطوات: أجهزة الطرد المركزي لتعليق الخلية في 43 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والخلايا resuspend في IB 10 مل تحتوي على 200 ميكرومتر CaCl _2. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى و resuspend الخلايا في IB 10 مل مع 500 ميكرومتر CaCl _2. بعد إعادة تعليق على الطرد المركزي في النهائي cardiomyocytes العقيمة EB تصفيتها (انظر 1.8) إلى كثافة من 50،000 خلية / مل.

1. معطف ساترة 4 غرف بشكل جيد مع laminin ميكروغرام 10 في جيدا والانتظار حتى يتم تجفيفها بالكامل.
2. ملء 1 مل من تعليق cardiomyocyte في كل بئر باستخدام micropipette مع طرف قطع. السماح للخلايا الالتزام ل1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
3. تمييع 10 ميكرولتر من 1 ملغ / مل FURA-02:00 محلول المخزون في EB 5 مل. الحفاظ على حل تلطيخ في الظلام.
4. خلع العازلة وغير مرتبط الخلايا من ساترة وماصة 0.5 مل من محلول التلوين في كل جانب. احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة تحت الهز معتدلة. وبعد ذلك، خلع حل تلطيخ، وغسل الخلايا مرة واحدة مع EB 1 مل وأخيرا 0،5 ملء EB مل في كل بئر. تجنب الضوء المباشر أثناء عملية التلوين والحفاظ على الخلايا الملون دائما في الظلام.

4. تسجيل تقصير الخليوي والكالسيوم ^{2 +} العابرين

1. وضع ساترة على حجرات م مضان عكسيةicroscope متصلة الكالسيوم خلية عضلية وانقباض نظام التسجيل. وضع قطب كهربائي العرف مع تدفق وأنبوب هروب رأس المال في أول بئر. Superfuse cardiomyocytes مع EB مل / دقيقة 1 و بدء التحفيز الكهربائي (20 V، 1 هرتز و 5 ميللي ثانية مدتها). السماح للخلايا للتكيف مع التحفيز لحوالي 2 دقيقة.
2. اختيار cardiomyocyte قضيب على شكل سليمة مع تثليم واضحة وانكماش مستمر. وضع الخلية في وسط الميدان البصرية وفتح قناة الكاميرا. توجيه الخلية أفقيا داخل منطقة الفيديو عن طريق تناوب محول تأطير الخلية وتحريك المرحلة المجهر.
3. ضبط حافة الكشف عن عناصر السيطرة على المنطقة الفيديو (الشكل 2)، فتح قناة الفلورسنت وسجل 10 حتي 15 تقلصات للحصول على تقصير الخلية الأولي والكالسيوم ^{2 +} عابرة.
4. إغلاق قناة ضوء المجهر لتجنب وصمة عار تبييض مضان. التبديل تدفق من خلال من EB إلى عينةتجاوز مع صمام الطريق و3-cardiomyocytes superfuse مع 1 مل من مفتش المريض. وقف ضخ الهواء إلى قبل البئر.
5. فتح قناة الخفيفة وتسجيل آخر 10 حتي 15 تقلصات للحصول على استجابة الخلية الحادة. تسجيل وقفة إغلاق القناة الضوء مرة اخرى. تكرار التسجيل بعد 5 دقائق (2) و.
6. إخراج الكهربائي للبئر. تنظيف أنابيب تماما مع EB ومتابعة البئر القادمة للحجرات ساترة.
7. تحليل الخلايا وتقصير كا ^{2 +} عابرة مع البرنامج IonWizard باستخدام "Edge-Length/Length" و "FURA 2-الرقمي طرح / نسبة" نافذة، على التوالي. حساب التغير في المئة من الخلايا الأولية وتقصير كا ^{2 +} عابرة للارتفاع القمة المشار إليها خط الأساس (BL٪ الذروة ح) لالحادة، وحد أدنى 2 والرد 5 دقائق.

حفز مثالين لقياس inotropy الخلوية في مجال cardiomyocytes الكبار (الشكل 2) باستخدام خلية عضلية كا ^{2 +} تسجيل انقباض والنظام وترد أدناه. الشكل 3 يعطي انطباعا للقياس السرعة، بينما في الشكل 4 تأثير الأجسام المضادة cardiodepressive للمريض ويظهر مع DCM.

في كل من الأمثلة، الأولي تقصير الخلايا والكالسيوم ^{2 +} عابرة خلال superfusion مع EB يحمل قمم واضحة وثابتة، وهو شرط مسبق للتحليل. نحن نعرف من التجربة أن الخلايا العارضة ل٪ BL الأولي ذروة ح في حدود 7 - 14٪ أفضل الدعوى لطلبنا، في حين cardiomyocytes مع انقباض الأولية أقل أو أعلى في كثير من الأحيان تميل لعرض التغييرات غير المبررة من تقصير الخلية. بعد تطبيق مفتش الرقابة، أي مفتش معزولة عن الأصحاء، inotropy من cardiomyocytes لا يزال Unchanged في جميع أنحاء القياس كله (الشكل 3A). في المقابل، ويتبع superfusion مع مفتش تحتوي على الأجسام المضادة من قبل cardiodepressive بإنخفاض قدره تقصير الخلية (الشكل 4A)، يرافقه انخفاض الكالسيوم ^{2 +} العابرين وهو عادة أقل وضوحا (الشكل 4B). نلاحظ عادة أن يتم تأسيس دولة جديدة ثابتة لكل من تقصير الخلية، وCA ^{2 +} العابرين، بعد 2 دقيقة التي يتم حفظها حتى نهاية القياس بعد 5 دقائق. المثال المعطى يظهر واضحا جدا تأثير سلبي في التقلص العضلي وذلك بانخفاض قدره تقصير الخلية بنسبة 54٪ من الكالسيوم ^{و2 +} العابرين بنسبة 31٪ بعد 5 دقائق. ومع ذلك، والتغيرات غالبا ما تكون أقل وضوحا. لذلك، حددنا حد العلوي والسفلي للinotropy السلبية والإيجابية كما يعني ± 2SD لمفتش الحكومة السيطرة على المجموعة الضابطة السليمة لتجنب نتائج إيجابية كاذبة. وبناء عليه، تعتبر الخلايا فقط كما ث التقلص العضلي سلبية أو إيجابيةالتغييرات الدجاجة من تقصير خلية يتجاوز هذه العتبة، ونحن مصممون على أن ما يقرب من 10٪ ±.

الشكل 1. الرسم البياني للكشف عن الأجسام المضادة عن طريق قياس انقباض cardiomyocyte: أولا، يتم استخراج عينات من المريض مفتش استخدام الألغام المضادة للمفتش الأعمدة sepharose و (باللون الأصفر). الثانية، يتم عزل cardiomyocytes من قلوب الفئران بواسطة الهضم الأنزيمي والملون مع FURA-2 (الضوء باللون الأزرق). وأخيرا، خلية تقصير والكالسيوم ^{2 +} يتم مراقبة العابرين عبر الإنترنت باستخدام الكالسيوم خلية عضلية وانقباض نظام تسجيل (تمييز باللون الأخضر).

الشكل 2. الفئران المعزولة cardiomyocyte المتمركزة في منطقة الفيديو لنظام انقباض خلية عضلية تسجيل. الرسم البياني أدناه تعرض الخلية آثار شدة محسوبة تستخدم للكشف عن الحافة. تشير الأسهم عناصر التحكم حافة الكشف. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3. المثال ممثلا لقياس التحكم. تقصير الخليوي (A) والكالسيوم ^{2 +} تم رصد عابرة (B) على الانترنت قبل (الأولي)، وذلك مباشرة (الحادة)، 2 دقيقة و 5 دقائق بعد superfusion مع مفتش. الخطوط الحمراء تشير إلى التوقف للقياس.

"الشكل 4" FO: المحتوى العرض = "4.5in" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/4237/4237fig4highres.jpg" />
الشكل 4. قياس مثال على عينة تحتوي على الأجسام المضادة مفتش cardiodepressive. تقصير الخليوي (A) والكالسيوم ^{2 +} تم قياس عابر (B) على الانترنت قبل (الأولي)، وذلك مباشرة (الحادة)، 2 دقيقة وبعد 5 دقائق superfusion مع مفتش. الخطوط الحمراء تشير إلى التوقف للقياس.

طريقة عرض يوفر وسيلة مناسبة للكشف عن الأجسام المضادة وظيفيا فعالة القلب في المرضى الذين يعانون من أصل DCM غير واضحة. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى، مثل الكشف عن الأجسام المضادة النشطة وظيفية ضد المستقبلات-β1 من تأثيرها على مستويات المعسكر ^6، لدينا طريقة مستقل لحاتمة محددة. بالطبع هناك غيرها من المقايسات مستقلة حاتمة هو موضح في الأدب، عد أي معدل المواليد ضرب cardiomyocytes ^13، قياس التيارات الكالسيوم في cardiomyocytes الكبار بحلول تقنية المشبك التصحيح أو انقباض الألياف العصبية معزولة من ^14. في ميزة لهذه الأساليب، ومقايسة المقدمة هنا هي أقل استهلاكا للوقت وتوفر الموضوعية زادت نتيجة للبروتوكول موحد. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح الكشف عن تأثير ذلك على انقباض والعابرين الكالسيوم داخل الخلايا في نفس الوقت.

على غرار بعد التمديدلها في المقايسات المختبر، يمكن الطعن في النتائج التي تم الحصول عليها مع أسلوب المقدمة من ظروف اصطناعية تطبيقها على الخلايا. ولم يبلغ عن مثقف الفئران حديثي الولادة cardiomyocytes إرفاق تفضيلي بين micropillars مع مسافة 30 ميكرومتر أو أقل من على ركائز ثابتة. وعندما تعلق على هذا الأخير، وجدت الخلايا لعرض ألياف الأكتين الإجهاد وغير مرتبة myofibers ^15. ومع ذلك، وصف التأثير المحتمل للألياف التوتر في مقايسة انقباض هنا قد تكون ضئيلة فقط لأن مثقف cardiomyocytes الكبار لفترة زمنية قصيرة جدا تصل إلى 6 ساعة التي قد تقلل من تشكيل تلك الألياف والخلايا وتقصير كا ^{2 +} عابرة ويشار إلى انقباض الأولي للخلية المعنية للحد من تأثير الفروق الفردية بين الخلايا. آخر القيد ارتفاع الطلب على حيوانات التجارب والوقت. ولذلك فإن هذه الطريقة لا تصلح للالفرز الفائق الإنتاجية من باتىالوالدان.

تطبيقات أخرى يمكن تصور للأسلوب. يمكن بسبب استقلال مستضد يتم تطبيقها على غيرها من الأمراض القلبية الوعائية مجهول السبب، حيث من المفترض لها تأثير المناعة الذاتية.

وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة أن تعدل القياسات انقباض لدراسة الآثار الفنية من المواد الأخرى. هذا يسمح تحليل التأثير المحتمل من الأدوية على القلب، والتي قد تكون مفيدة في مثل تطوير العقاقير والاختبار. وإلى جانب المعايير الأساسية التي تقدمها التغيرات في الخلايا وتقصير كا ^{2 +} من خط الأساس، يمكن الحصول على مزيد من المعلومات من القياسات التي تسمح بتعريف أكثر تفصيلا للتأثير ملاحظ. على سبيل المثال، يمكن حساب سرعة رحيل والعودة من الأحداث التي يمكن أن تقصير الخلية تشير إلى وجود تأثير الانقباضي الانبساطي ومحددة من المخدرات أو الأجسام المضادة.