Summary

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Published: August 24, 2012
doi:

Summary

In questo protocollo, che aggiorniamo i recenti progressi nel campo dell'imaging Ca<sup> 2 +</sup> Segnali di neuroni GFP-tagged in fettine di tessuto cerebrale con un rosso fluorescente Ca<sup> 2 +</sup> Indicatore di colorante.

Abstract

Nonostante un aumento enorme nella nostra conoscenza dei meccanismi alla base della codifica delle informazioni nel cervello, una questione centrale relativa alle tappe precise molecolari così come l'attività dei neuroni specifici nuclei multi-funzionale delle aree cerebrali come l'ipotalamo rimangono. Questo problema si include l'identificazione dei componenti molecolari coinvolti nella regolazione delle cascate di trasduzione del segnale diverse neuro ormone. Elevazioni di Ca 2 + intracellulare svolgono un ruolo importante nella regolazione della sensibilità dei neuroni, sia a livello di trasduzione del segnale e nei siti sinaptici.

Sono emersi nuovi strumenti per identificare neuroni nel miriade di neuroni cerebrali esprimendo la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo di un promotore specifico. Per monitorare tempo e nello spazio stimolo-indotto di Ca 2 + risposte in GFP-tagged neuroni, un non-verde fluorescente Ca 2 + indicatore colorante nresponsabili politici da utilizzare. Inoltre, la microscopia confocale è un metodo preferito di neuroni immagini singole fette di tessuto a causa della sua capacità di visualizzare neuroni in diversi piani di profondità all'interno del tessuto e di limitare out-of-focus fluorescenza. Il raziometrico Ca 2 + indicatore fura-2 è stato usato in combinazione con GFP-tagged neuroni 1. Tuttavia, il colorante viene eccitato da raggi ultravioletti (UV). Il costo del laser e la limitata profondità di penetrazione della luce UV ottico ostacolato il suo uso in molti laboratori. Inoltre, fluorescenza GFP può interferire con le fura-2 segnali 2. Pertanto, abbiamo deciso di utilizzare un rosso fluorescente Ca 2 + indicatore colorante. L'enorme cambiamento Strokes di fura-rosso permette analisi multicolore della fluorescenza rossa in combinazione con GFP usando una singola lunghezza d'onda di eccitazione. Abbiamo avuto buoni risultati precedentemente con fura-rosso, in combinazione con GFP-tagged neuroni olfattivi 3. I protocolli di fettine di tessuto olfattivi sembrava funzionare equally bene in neuroni ipotalamici 4. Fura-rosso sulla base di Ca 2 + di imaging è successo anche in combinazione con GFP-tagged pancreatiche β-cellule e GFP-tagged recettori espressi in cellule HEK 5,6. Una peculiarità del piccolo fura-red è che la sua intensità di fluorescenza a 650 nm diminuisce per l'indicatore si lega calcio 7. Pertanto, la fluorescenza di neuroni di sosta con bassa concentrazione di Ca 2 + ha intensità relativamente elevata. Va notato, che gli altri rossi Ca 2 + indicatori di coloranti esistono o sono in fase di sviluppo, che potrebbe dare risultati migliori o migliorate di neuroni e aree cerebrali.

Protocol

1. Preparazione della soluzione e gel di agarosio Preparare la soluzione extracellulare secondo la tabella con acqua bidistillata. Il pH sarà ~ 7,3 dopo 10 min con aerazione carbogeno (95% O 2/5% CO 2), l'osmolarità 300 mOsm 8. Se una osmolarità superiore è necessario, esso può essere regolato aggiungendo più glucosio (1 mM mOsm uguale a 1). La soluzione viene filtrata due volte usando un filtro a membrana 0,2 micron per eliminare particelle di polvere e possibili co…

Discussion

Una questione importante nel campo delle neuroscienze è quello di capire come il cervello elabora le informazioni sociale. La fonte principale delle informazioni necessarie per il riconoscimento sociale è codificato da segnali olfattivi o feromonale. La rilevazione di questi segnali da parte delle popolazioni neuronali nel naso e il riconoscimento dei segnali nel cervello, in particolare l'ipotalamo, svolgono un ruolo fondamentale in molti processi sociali ed ormoni influenza e di altri fattori neuroendocrini <sup…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i nostri colleghi che hanno partecipato ai lavori qui riassunte. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), 'analisi integrativa dell'olfatto' della DFG Schwerpunktprogramm 1392 e dalla Fondazione Volkswagen (TLZ). TLZ è professore Lichtenberg della Fondazione Volkswagen.

Materials

Name Company Cat. N°
Agar Sigma A1296
Fura-red/AM Invitrogen F-3021
Pluronic F-127 Sigma P2443
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific BP231
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50 Zeiss 9770170
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50 Zeiss 9920120
O2/CO2 Incubator, CB210-UL Binder 0019389
Super glue, Loctite 406TM Henckel 142580
Double spatulas, spoon shape Bochem 3182
Microspoon spatulas, spoon shape Bochem 3344
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff – 7mm Blades Fine Science Tools 15370-52
Spring Scissors, Vannas – 3mm Blades Fine Science Tools 15000-00
Wagner Scissors Fine Science Tools 14071-12
Medical Forceps, Dumont 7b Fine Science Tools 11270-20
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27) Warner Instruments 64-0238
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100 Zeiss n.a.

References

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Citer Cet Article
Schauer, C., Leinders-Zufall, T. Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (66), e4213, doi:10.3791/4213 (2012).

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