Dopamin belirgin hücre gövdeleri ve dopamin nöron dendritler içeren Ortabeyin çekirdekler, düzenlenmiştir. Burada substantia nigra (SN) ve kemirgenlerde ventral tegmental alan (VTA) ve orta beyin çekirdeklerinde dopamin regülasyonu üzerine, böylece bir diseksiyon ve örnek işleme sonuçları maksimize etmek için yaklaşım, sonuç ve görüşlerini açıklar.
Dopamin MSS bir gayretle çalıştı nörotransmitterdir. Nitekim, lokomotor aktivite ve ödül ile ilgili davranışı kendi katılımı dopamin regülasyonu ile ilişkili moleküler eksikliklerin bir soruşturma beş yıl teşvik etti. Nigrostriatal ve mesoaccumbens yolların terminal alanında bölgelerde düzenlenmesi için moleküler temeli üzerine beyin odak dopamin yönetmeliğin bu soruşturmaların çoğunluğu, striatum ve nukleus akumbens. Ayrıca, bu tür çalışmaların sadece ıslak doku ağırlığı normale dopamin doku içeriğinin analizi üzerinde yoğunlaşmıştır. Böyle tirozin hidroksilaz (TH) protein, TH fosforilasyon, dopamin taşıyıcısı (DAT) ve veziküler monoamin transporter 2 (VMAT2) protein olarak, dopamin düzenleyen proteinlerin incelenmesi genellikle aynı örnek dopamin doku içeriğinin analizini içermez. Dopamin doku içeriği ve düzenleyen proteinleri (post-tra dahil olmak üzere her iki analiz yeteneğinslational değişiklikler) protein düzeyi ve TH, DAT, ya VMAT2 fonksiyonu ile dopamin arasındaki ilişkiyi yorumlama doğasında güç verir, aynı zamanda örnek ekonomisi uzatır sadece. Henüz daha az maliyet ve çevirmenize araştırmacılar 'seçim hemen her paradigma dopamin moleküler düzenlenmesi irdeliyoruz üretir.
Biz orta beyindeki analizleri odaklanır. SN ve VTA genellikle dopamin regülasyonu en çalışmalarda ihmal rağmen, bu çekirdekler kolayca uygulama ile disseke edilir. Kapsamlı bir dopamin doku içeriği ve TH okuma, DAT, ya VMAT2 yapılabilir. Orada davranışı SN ve VTA dopamin fonksiyonunun etkisi literatürde filizlenen ve orada 1-5 eksojen maddeler veya hastalık süreçleri sıkışmaları edilir. Ayrıca, bu tür büyüme faktörleri gibi bileşikler SN veya VTA içinde nispeten büyük ölçüde, dopamin ve dopamin düzenleyen proteinler üzerinde derin bir etkiye sahiptir <sup> 6-8. Bu nedenle, bu yöntem özel tedaviler davranış ve dopamin regülasyonu modüle nasıl Araştırmalarına uzatmak istiyorsanız laboratuvarlar referans sunulmuştur. Burada, çok adımlı bir yöntem dopamin doku içeriğinin analizi, TH protein düzeyleri, DAT, ya VMAT2 ve kemirgen ortabeyin gelen substantia nigra ve VTA gelen TH fosforilasyon için sunulmuştur. TH fosforilasyon analizi sadece TH aktivitesi nasıl düzenlendiği, aynı zamanda belirli bir paradigma içinde somatodendritik çekirdeklerinde etkilenen sinyal kademelerin önemli anlayışlar elde edebilirsiniz.
Biz bu iki çekirdeğin ve her çekirdek (Şekil 1) için spesifik in vivo dopamin regülasyonu moleküler mekanizmaları, ortaya bir profil üreten disseke doku örnek işleme ayırmak diseksiyon tekniği örneklerle gösterecek.
Şekil 1 'de belirtildiği gibi, yukarıda detaylı yöntemler dopamin birden readouts ve sıçan veya fare ya elde SN ya VTA bir numuneden olan proteinleri düzenleyen TH, DAT ve VMAT2 vermelidir. Yine, bu Protokolün yürütülmesi yararları araştırmacı dopamin hemen her deneysel paradigma altında in vivo olarak düzenlenir ve bunu yaparken, herhangi bir gerekli hayvan sayısını azaltarak önemli deneysel kaynak tasarrufu nasıl bir operasyonel eşleştirilmiş girilmesi gerekmektedir olmalarıdır…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma ve 2,10 olarak anılan, finansmanı, Yaşlılık Araştırma, Edward P. Stiles Fonu ve Kuzeybatı Louisiana Biyomedikal Araştırma Vakfı Amerikan Federasyonu MF Salvatore bir araştırma hibeler ile, kısmen sağlandı ve Ike Muslow predoctoral Kardeşliği BS Pruett için, LSU Sağlık Bilimleri Merkezi-Shreveport.
HPLC system:
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.
The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.
Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | – J.T. Baker | 4095-02 |
Trizma Base | Sigma | T1503-1KG |
Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG |
Glycerol | Sigma | G8773-500 mL |
PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG |
dPBS | Gibco | 21600-069 |
Tween20 | Sigma | P1379-500 mL |
Glycine | Sigma | G8898-1KG |
Ponceau S | Fluka | 81460 |
Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G |
Dithiothreitol | Sigma | D-9163 |
Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL |
Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo- Fisher Scientific | 23223 |
Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 |
[125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer |
Table 2. Specific reagents.
Reagents | Formulas |
10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 |
1% SDS (pH to 8.2) |
|
Copper II Sulfate Solution |
|
3X Sample Buffer |
|
1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 |
10X Running Buffer (Makes 4 L) |
|
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) |
|
Ponceau |
|
.2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 |
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) |
|
10X Blot Buffer (Makes 4 L) |
|
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11.