דופאמין הוא מוסדר בבירור בגרעין המוח התיכון, אשר מכילים תאים הגופות דנדריטים של נוירונים דופאמין. כאן נתאר את הגישה לנתיחה ו מדגם הטיפול על מנת למקסם את התוצאות, ולכן מסקנות ותובנות, על ויסות הדופמין בגרעין המוח התיכון של nigra substantia (SN) ואזור tegmental הגחוני (VTA) במכרסמים.
דופמין הוא מוליך עצבי למד במרץ מערכת העצבים המרכזית. אכן, את מעורבותה בפעילות של תנועה ותגמול הקשור להתנהגות טיפחה חמישה עשורים החקירה לעניין הליקויים מולקולריים הקשורים תקנה דופמין. רוב אלה שאלות של רגולציה הדופמין במוח המיקוד על הבסיס המולקולרי של ויסות שלה את שדה באזורים מסוף המסלולים nigrostriatal ו mesoaccumbens, הסטריאטום ו הנסמך הגרעין. יתרה מכך, מחקרים אלה התמקדו בניתוח תוכן רקמות דופמין נורמליזציה עם משקל רק רקמות רטוב. חקירת החלבונים המווסתים דופמין, כגון hydroxylase החלבון טירוזין (ה '), זירחון TH, טרנספורטר דופאמין (DAT), ו טרנספורטר אוקסידאז שלפוחי 2 (VMAT2) חלבון לעתים קרובות אינם כוללים ניתוח של תוכן רקמות הדופמין מדגם זהה. היכולת לנתח את תוכן הן רקמות דופאמין חלבונים המסדירים שלה (כולל פוסט traשינויים nslational) לא רק נותן כוח אינהרנטי לפרש את הקשר של דופמין עם רמת חלבון והתפקוד של TH, DAT, או VMAT2, אלא גם מרחיב את הכלכלה המדגם. זה מיתרגם עלות פחות, ובכל זאת מייצרת תובנות תקנה המולקולרי של הדופמין הפרדיגמה כמעט כל בחירה של החוקרים.
אנו מתמקדים בניתוח של המוח התיכון. למרות SN ו VTA מוזנחים בדרך כלל רוב המחקרים תקנה דופמין, גרעינים אלה גזור בקלות עם הפרקטיקה. Readout מקיפה של תוכן רקמות TH דופאמין, DAT, או VMAT2 ניתן לבצע. שם הוא המתפתחת ספרות על ההשפעה של תפקוד הדופאמין SN ו VTA על ההתנהגות, ועל הפרעות וחדירות חיצוניות של חומרים חיצוניים או תהליכי מחלה החלים בהם 1-5. יתר על כן, תרכובות כגון גורמי גדילה יש השפעה עמוקה על חלבונים דופאמין דופאמין מווסת במידה יחסית רבה יותר SN או VTA <sup> 6-8. לכן, שיטה זו מוצג לעיון למעבדות אשר רוצים להרחיב את השאלות שלהם על כמה טיפולים ספציפיים לווסת התנהגות ורגולציה דופמין. הנה, שיטת רב שלבי מוצג על ניתוח תוכן רקמות דופמין, רמות החלבון של TH, DAT, או VMAT2 ו זרחון TH מ nigra substantia ו VTA מן המוח התיכון מכרסם. ניתוח של זירחון TH יכולה להניב תובנות משמעותיות לתוך לא רק כיצד הפעילות TH מוסדר, אלא גם את מפלי איתות מושפע בגרעין somatodendritic פרדיגמה נתונה.
אנו מדגימים את הטכניקה לנתיחה כדי לבודד אותם גרעינים 2 ו עיבוד דגימת רקמה גזור שמייצר פרופיל חושף מנגנונים מולקולריים תקנה דופמין in vivo, ספציפיות עבור כל גרעינים (איור 1).
כפי שמתואר באיור 1, השיטות שפורטו לעיל צריך להניב readouts רבים של דופאמין ויסות שלה חלבונים ה, DAT, ו VMAT2 ממדגם אחד או SN VTA לקבל חולדה או עכבר. שוב, היתרונות של ביצוע זה הן כי פרוטוקול החוקר יכול להשיג readouts מבצעית המותאמות של כמה דופמין מוסדר in vivo תחת הפרדיגמה כמעט כל ניסי…
The authors have nothing to disclose.
מימון עבור עבודה זו, וכפי שצוטט 2,10, נקבע, בין השאר, על ידי פרסים מחקר להעניק MF סלווטורה של הפדרציה האמריקאית לחקר הזיקנה, אדוארד פ 'סטיילס אמון הקרן ביו קרן המחקר של מערב לואיזיאנה, וכדי BS פרואט מן אחוות אייק Muslow Predoctoral, LSU למדעי הבריאות מרכז, Shreveport.
HPLC system:
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.
The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.
Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | – J.T. Baker | 4095-02 |
Trizma Base | Sigma | T1503-1KG |
Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG |
Glycerol | Sigma | G8773-500 mL |
PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG |
dPBS | Gibco | 21600-069 |
Tween20 | Sigma | P1379-500 mL |
Glycine | Sigma | G8898-1KG |
Ponceau S | Fluka | 81460 |
Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G |
Dithiothreitol | Sigma | D-9163 |
Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL |
Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo- Fisher Scientific | 23223 |
Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 |
[125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer |
Table 2. Specific reagents.
Reagents | Formulas |
10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 |
1% SDS (pH to 8.2) |
|
Copper II Sulfate Solution |
|
3X Sample Buffer |
|
1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 |
10X Running Buffer (Makes 4 L) |
|
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) |
|
Ponceau |
|
.2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 |
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) |
|
10X Blot Buffer (Makes 4 L) |
|
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11.