और माउस मस्तिष्क प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस का उपयोग में Dendrites और कांटा के आनुवंशिक हेरफेर विज़ुअलाइज़ेशन<em> Utero में</em> Electroporation
Summary
इस लेख में विस्तार से utero में मस्तिष्क प्रांतस्था और चूहों में E14.5 में हिप्पोकैम्पस electroporate प्रोटोकॉल का वर्णन है. हम यह भी पता चलता है कि यह एक मूल्यवान dendrites और कांटा के लिए इन दोनों क्षेत्रों में मस्तिष्क का अध्ययन विधि है.
Abstract
In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells.
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.
Protocol
Discussion
IUE अंतरिक्ष में ही नहीं बल्कि समय में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. हम यहाँ दिखाने के लिए कि इस तकनीक के लिए कल्पना और आनुवंशिक हेरफेर और dendrites चूहों के मस्तिष्क प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस में कांटा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पहले से उद्धृत लाभ के अलावा, यह ध्यान देने योग्य बात है कि IUE, विधि Golgi करने के लिए इसके विपरीत में, immunohistochemistry साथ या स्वस्थानी संकरण जो फेनोटाइप करने के लिए electroporated कोशिकाओं उदाहरण के लिए अनुमति देता है में जोड़ा जा सकता है लायक है. यह भी महत्वपूर्ण है उल्लेख है कि इस प्रक्रिया स्पष्ट मस्तिष्क विरूपताओं को उसके रिश्तेदार के invasiveness के बावजूद प्रेरित नहीं करता. इसके अलावा, सेलुलर स्तर पर, IUE electroporated 13 न्यूरॉन्स की electrophysiological गुण संशोधित नहीं करता है. हालांकि हमारे प्रदर्शन dendrite और रीढ़ morphologies के दृश्य पर ध्यान केंद्रित, E14.5 पर cortical या hippocampal न्यूरॉन्स की IUE भी अक्षतंतु गठन और मार्गदर्शन के रूप में इस तरह के अन्य विकासात्मक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जोड़ने मेंition, प्रोटोकॉल के एक ही प्रकार के भ्रूण के विकास के अन्य चरणों में लागू किया जा सकता है विभिन्न आबादी को लक्षित है. उदाहरण के लिए, एक developmentally बहुत देर cortical E18.5 में electroporation प्रतिमान को astrocytic 1 progenitors में अभिव्यक्ति ड्राइव किया जा सकता है. इसी प्रकार, जबकि E14.5 में हिप्पोकैम्पस के एक electroporation CA1 – CA3 पिरामिड, न्यूरॉन progenitors और दांतेदार ग्रेन्युल सेल पूर्वज एक ही समय में लक्षित करने की अनुमति देता है, एक देर hippocampal electroporation (E18.5 या जल्दी प्रसव के बाद) के लिए विभिन्न दांतेदार ग्रेन्युल लक्ष्य की अनुमति होगी 14 progenitors. इस मामले में, वर्तमान की तीव्रता के रूप में डीएनए की मात्रा इंजेक्शन के रूप में अच्छी तरह से बढ़ सकता है.
IUE द्वारा शुरू transgenes episomal रहना दिखाई देते हैं और इसलिए कर रहे हैं कोशिकाओं लगातार कोशिका विभाजन के बाद से खो दिया है. न्यूरॉन्स के रूप में postmitotic कोशिकाओं में, तथापि, episomal transgenes महीने के लिए सक्रिय electroporation के बाद लंबे समय तक अध्ययन 13 अनुमति रहना15,. हमारे अध्ययन में, हम उज्ज्वल + GFP कोशिकाओं मनाया जन्म के बाद 7 सप्ताह (नवीनतम समय बिंदु हम विश्लेषण) कि भ्रूण का संकेत cortical या hippocampal neuronal transgene की लगातार अभिव्यक्ति में IUE परिणाम जल्दी विकास के समय अंक से ऊपर का उपयोग कर व्यापारियों के लक्ष्य के लिए वयस्कता के लिए.
तकनीक का एक वर्तमान सीमा है कि यह मुश्किल है electroporated कोशिकाओं की कुल संख्या से अधिक ठीक नियंत्रण लागू है. हालांकि, डीएनए समाधान के इंजेक्शन की मात्रा कम करके, हम पता चला है कि यह संभव है कुछ कोशिकाओं लेबल और अलग GFP + कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से उनके spines के वृक्ष के समान द्रुमायण कल्पना. ट्रांसफ़ेक्ट क्षेत्र के आयाम भी वर्तमान और दालों की संख्या या electroporation paddles के व्यास की तीव्रता के रूप में electroporation की पैरामीटर संशोधित करके समायोजित किया जा सकता है.
कुल मिलाकर IUE एक तरीका है कि लागू करने के लिए आसान, तेजी से है औरकुशल और dendrites vivo में कांटा अध्ययन.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के लिए उनकी मदद के लिए धन्यवाद डा. कैथलीन Mathers, डा. जीन फिलिप Mocho और डा. योलान्डा Saavedra Torres सड़न रोकनेवाला प्रक्रियाओं के तहत utero electroporation में प्रदर्शन चाहते हैं, और चित्र तैयार करने के लिए उसकी मदद के लिए हेली लकड़ी.
EP यूरोपीय बायोकेमिकल सोसायटी के एक लंबे समय तक संघ (FEBS) फैलोशिप और वेलकम ट्रस्ट अनुदान द्वारा एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद (MRC) कैरियर के विकास फैलोशिप, महिंद्रा से एलिजाबेथ फिशर और विक्टर Tybulewicz के (080174/B/06/Z) द्वारा समर्थित किया गया था , HW से एक EMBO दीर्घकालिक फैलोशिप और एक MRC छात्रावस्था द्वारा आरए द्वारा. यह काम वेलकम ट्रस्ट 086947/Z/08/Z () से एक परियोजना अनुदान और अनुदान सहायता के लिए चिकित्सा अनुसंधान परिषद (U117570528) से FG द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | |||
| Preparation of needles and DNA solution for injection | ||||||
| Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | ||||
| Fast Green | Sigma | F-7258 | ||||
| Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | ||||
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl | |||
| Material for surgery | ||||||
| Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | ||||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | ||||
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | ||||
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | ||||
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | ||||
| Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson & Johnson) | W9074 | ||||
| Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | ||||
| Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | ||||
| Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | ||||
| Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | |||||
| Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | ||||
| Eye gel Viscotears | Novartis | |||||
| Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | ||||
| Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | |||||
| Electroporation | ||||||
| Electroporator | BTX | ECM830 | ||||
| Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | ||||
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | ||||
| Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | ||||
| Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | ||||
| Tissue processing | ||||||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||||
| Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | ||||
| Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | ||||
| Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | ||||
| Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 | ||||
References
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