Proteína amplificação cíclica misfolding de príons
Summary
Proteína de amplificação cíclica misfolding (PMCA) é um ensaio in vitro em para o estudo da conversão de prião e as barreiras de tensão e espécies. Também pode ser utilizado como um ensaio de detecção de prião.
Abstract
Os príons são os agentes infecciosos que causam a encefalopatia espongiforme inevitavelmente fatal transmissível (EET) em animais e seres humanos 9,18. A proteína de prião tem duas isoformas distintas, a não infecciosa da proteína codificada hospedeira (PrP C) e a proteína infecciosa (PrP Sc), uma isoforma anormal de dobrado PrP C 8.
Um dos desafios de trabalhar com agentes prião é o longo período de incubação antes do desenvolvimento de sinais clínicos após a inoculação de acolhimento 13. Isto tradicionalmente, imposto estudos bioensaio longas e caras animais. Além disso, as propriedades bioquímicas e biofísicas da PrP Sc ainda são pouco caracterizados devido à sua conformação invulgar e estados de agregação.
PrPSc pode semear a conversão da PrP C e PrP Sc in vitro 14. PMCA é uma técnica in vitro, em que toma advantage desta capacidade utilizando ciclos de sonicação e a incubação para a produção de grandes quantidades de PrP Sc, a uma taxa acelerada, a partir de um sistema contendo quantidades em excesso de PrP C e pequenas quantidades de sementes a PrP Sc 19. Esta técnica provou ser eficaz para recapitular a especificidade de espécie e estirpe de PrP Sc conversão da PrP C, para emular interferência estirpe do prião, e para amplificar os níveis muito baixos de PrP Sc em tecidos infectados, fluidos e amostras ambientais 6,7,16, 23.
Este trabalho detalha o protocolo PMCA, incluindo recomendações para minimizar a contaminação, gerando resultados consistentes, e quantificar esses resultados. Também discutimos várias aplicações PMCA, incluindo a geração e caracterização de cepas de príon infeccioso, interferência tensão prião, e na detecção de príons no ambiente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desafios da amplificação príons infecciosos são os longos períodos de incubação e as despesas de experimentos de vivo. A técnica PMCA é um meio rentável para ampliar agentes príon infeccioso. Vários laboratórios confirmaram a capacidade de amplificar PMCA com precisão as estirpes de priões in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24.
Doenças de priões, pode ser transmitida entre as espécies. Bessen e Marsh efetivamente inoculados hamsters com encefalo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Vesper Fe Marie Ramos para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 e G20RR024001) e do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (2R01 NS052609).
Materials
| Reagent / Equipment | Manufacturer | Cat. Number |
| Misonix 3000 | Misonix | S-3000 |
| Misonix 4000 | Misonix | S-4000 |
| Tenbroeck Tissue Grinder | Kontes | 885000-0007 |
| Neslab EX-7 Water Bath | Thermo Electron | Neslab EX-7 |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Thermo Scientific | AB-0451 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11 697 498 001 |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-00 |
| DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV |
| Versi-Dry Lab Soakers | Fisher Scientific | 14 206 28 |
| Repti Therm Heater | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
References
- Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease. PLoS pathogens. 7, e1001317 (2011).
- Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype. PLoS Pathog. 5, e1000421 (2009).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent. J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).
- Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, 757-768 (2008).
- Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. Cell-free propagation of prion strains. EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).
- Caughey, B., Raymond, G. J. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).
- Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).
- Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. Competition between different scrapie agents in mice. Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).
- Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. Detection of infectious prions in urine. FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).
- Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers. PLoS Pathog. 4, e1000139 (2008).
- Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously. J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).
- Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature. 370, 471-474 (1994).
- Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N. Virology. 387, 3235-3240 (2009).
- Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. Environmental sources of scrapie prions. J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).
- Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area. Prion. 3, 171-183 (2009).
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, 136-144 (1982).
- Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411, 810-813 (2001).
- Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).
- Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type. Journal of virology. , (2011).
- Schutt, C. R., Bartz, J. C. Prion interference with multiple prion isolates. Prion. 2, 61-63 (2008).
- Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource. Journal of. 84, 5706-5714 (2010).
- Shikiya, R. A., Bartz, J. C. In vitro generation of high titer prions. Journal of virology. , (2011).
- Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA. Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).
