Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones
Summary
En este artículo se describe una secuencia optimizada de eventos para obtener imágenes multimodal de los injertos celulares en el cerebro de los roedores por medio de: (i) en la bioluminiscencia in vivo y la resonancia magnética, y (ii) el análisis post mortem histológico. La combinación de estas modalidades de imágenes en un solo animal permite la evaluación del injerto celular con alta resolución, sensibilidad y especificidad.
Abstract
Durante la década pasada, el trasplante de células madre ha ganado un creciente interés como modalidad terapéutica primaria o secundaria para una variedad de enfermedades, tanto en estudios preclínicos y clínicos. Sin embargo, hasta la fecha los resultados con respecto a los resultados funcionales y / o regeneración de los tejidos después de un trasplante de células madre son muy diversas. Por lo general, un beneficio clínico que se observa, sin conocimiento profundo de los mecanismo (s) 1. Por lo tanto, los múltiples esfuerzos han llevado al desarrollo de las diferentes modalidades de imágenes moleculares para controlar el injerto de células madre con el fin último de evaluar con precisión la supervivencia, el destino y la fisiología de las células madre injertadas y / o su entorno micro. Los cambios observados en uno o más parámetros determinados por imagen molecular podría estar relacionado con el efecto clínico observado. En este contexto, nuestros estudios se centran en el uso combinado de imágenes de bioluminiscencia (BLI), imágenes por resonancia magnética (RM) e histológicos analysis para evaluar el injerto de células madre.
BLI se utiliza comúnmente para no invasiva realizar el seguimiento de celda y vigilar la supervivencia celular en el tiempo después del trasplante 2-7, basado en una reacción bioquímica en donde las células que expresan el gen de luciferasa-reportero son capaces de emitir luz siguiente interacción con su sustrato (por ejemplo, D- luciferina) 8, 9. RM por otro lado es una técnica no invasiva que es aplicable clínicamente 10 y se puede utilizar para localizar con precisión los injertos celulares con una resolución muy alta 11-15, aunque su sensibilidad depende en gran medida el contraste generado después de marcado de la célula con un agente de contraste para MRI . Por último, post mortem análisis histológico es el método de elección para validar los resultados de investigación obtenidos con técnicas no invasivas con mayor resolución y sensibilidad. Por otra parte punto final el análisis histológico nos permite realizar un análisis detallado fenotípica de las células injertadas y / o el tejido circundante, baSED en el uso de proteínas fluorescentes reportero y / o etiquetado directo de células con anticuerpos específicos.
En resumen, aquí visualmente demostrar la complementariedad de BLI, la resonancia magnética y la histología de desentrañar las células madre y diferente / o asociados con el medio ambiente las siguientes características injerto de células madre en el SNC de ratones. A modo de ejemplo, la médula ósea derivados de las células del estroma, la ingeniería genética para expresar la mayor proteína verde fluorescente luciferasa (eGFP) y Firefly (fluctuaciones), y marcado con color azul fluorescente micras de tamaño de partículas de óxido de hierro (MPIOs), serán injertados en el sistema nervioso central de ratones inmunocompetentes y los resultados serán monitoreados por BLI, la resonancia magnética y la histología (Figura 1).
Protocol
Discussion
En este reporte se describe un protocolo optimizado para la combinación de tres técnicas de imagen complementarias (BLI, la resonancia magnética y la histología) para la caracterización detallada de los implantes celulares en el sistema nervioso central de ratones inmunes competentes. Una combinación de etiquetado del gen de las células, sobre la base de la modificación genética con los genes reporteros de luciferasa de luciérnaga y eGFP, y un etiquetado directo de células con GB MPIO, conduce a una evaluaci?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| IMDM | Lonza | BE12-722F | Component of the cell growth medium CEM |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Component of the cell growth medium CEM |
| Horse serum | Gibco | 1605-122 | Component of the cell growth medium CEM |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140 | Component of the cell growth medium CEM |
| Fungizone | Gibco | 15290-018 | Component of the cell growth medium CEM |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Puromycine | Invivogen | ant-pr-1 | |
| trypsin | Gibco | 25300 | |
| GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
| D-luciferin | Promega | E1601 | |
| Ketamine (Ketalar) | Pfizer | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer Health care | ||
| Isoflurane | Isoflo | 05260-05 | |
| 0.9% NaCl solution | Baxter | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| sucrose | Applichem | A1125 | |
| Micro-injection pump | KD scientific | KDS100 | |
| Photon imager | Biospace Lab | ||
| 9.4T MR scanner | Bruker Biospin | Biospec 94/20 USR | |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| Mycrom HM cryostat | Prosan | HM525 | |
| syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 gauge needle | Hamilton | 7762-03 | |
| Photo Vision software | Biospace Lab | ||
| M3vision software | Biospace Lab | ||
| Paravision 5.1 software | Bruker Biospin | ||
| Amira 4.0 software | Visage Imaging |
References
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