Summary

単純ヘルペスウイルスの待ち時間と再活性化の研究の主ニューロン培養システム

Published: April 02, 2012
doi:

Summary

プロトコルは、単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)の待ち時間と再活性化ヘルペスを研究するための効率的かつ再現可能なモデルシステムを説明しています。アッセイは、均質な交感神経ニューロンの培養を採用し、RNA干渉と組換えタンパク質の発現を含むさまざまなツールを使用してウイルスニューロンの相互作用の分子解剖を可能にします。

Abstract

単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)は、末梢神経における生涯潜伏感染を確立する単純。この潜在的な貯水池は、伝送を確保し、臨床疾患に寄与する再発再活性化イベントのソースです。現在の抗ウイルス薬は、潜在的な貯留層に影響を与えないし、ワクチンはありません。溶菌複製物の分子の詳細は十分に特徴付けされているが、ニューロンの遅延を制御するメカニズムは、とらえどころのないままになります。待ち時間の私達の現在の理解は、ウイルス遺伝子の要件と免疫応答の役割を定義するために欠かせないされている小さな動物モデルを使用して、in vivo試験から導出されます。しかし、それは生きた動物の免疫または非神経支持細胞によって媒介される感染症の、より一般的な結果から、ウイルスニューロンの関係で特定の効果を区別することは不可能である。さらに、動物実験では、ホストを操作するため、高価な時間がかかり、使用可能なオプションの点で制限されているプロセス。これらの制限を克服するために、ニューロンのみのシステムは、必死に待ち時間と再活性化 in vivo特性再現が均質性とアクセシビリティの観点から組織培養の利点を提供することが必要になります。

ここでは、適合するHSV-1潜伏と再活性化を研究するためにラットの上頚神経節(SCG)( 図1)から培養された主要な交感神経ニューロンを活用したin vitroモデル内に存在するほとんどすべての希望する条件の場合。非神経細胞を除去した後、ほぼ均質体TrkA +ニューロン培養物は、溶菌複製を抑制するためにアシクロビルの存在(ACV)はHSV-1に感染しています。 ACVの除去に続いて、忠実に待ち時間の受け入れの特徴を示す非生産的なHSV-1感染が効率的に確立されています。特に、溶解性のmRNA、タンパク質、感染性ウイルスはさらに選択の非存在下で、検出限界以下になりますが、潜伏関連転写(LAT)急行イオンは、神経細胞核内に保持されます。ウイルスゲノムは、ニューロンあたり25の平均コピー数で維持されており、生産PI3-キナーゼ/ Aktシグナル伝達や神経成長因子1の単純な撤退を妨害することによって複製するように誘導することができる。ウイルスの溶菌タンパク質US11に融合した組換えHSV-1エンコーディングEGFPは、容易に定量化され再活性化に起因する複製の機能、リアルタイムのマーカーを提供する。化学的処理に加えて、このようなレンチウイルスベクターを介したRNA干渉または遺伝子送達などの遺伝の方法論は、正常動物では、非常に困難、不可能ではないです。機構の研究を可能にするシステムに適用することができます。要約すると、SCGベースのHSV-1の遅延/再活性化システムは、ニューロンのHSV1待ち時間と再活性化、そのソリューションは、新しい治療法の開発に新鮮な洞察を提供することがあり、ウイルス分野でも長年のパズルを制御する分子機構を解明するための強力な、必要なツールを提供していますターゲットT彼は、ヘルペスウイルスリザーバーを潜在。

Protocol

1。ラット胚からSCG神経細胞の単離および培養 このプロトコルを理解するための有用なコンテキストを提供し、するために以前の文献の包括的な議論のためのそのin vitro培養、プレートコーティング基板、無血清培地の成分でSCGのための基礎を含むSCGニューロン培養の確立された方法、読者は参照2から4と ​​呼ばれています。 SCG神経細胞のソー?…

Discussion

この主要なニューロンの培養と感染システムは、HSV-1潜伏と再活性化の分子機構を探索するためのシンプルで効果的な方法を提供します。システムは、忠実に反復するヒトの感染の両方で、ライブ動物モデルで定義された待ち時間の受け入れの特徴を。ウイルスはSCGの文化に潜在されている場合、感染性粒子とウイルスの溶菌遺伝子産物を検出することはできません。潜伏感染し…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、この原稿を向上させるために助けた彼らの思慮深い提案のためのレビューに感謝します。この作品は、NIHからMVC(NS21072、HD23315)、ACW(GM61139、S10RR017970)とIM(AI073898、GM056927)への補助金によって支えられている。 MKは、NIHの訓練助成金(5T32 AI007180)によって部分的にサポートされていました。

Materials

Reagent Company Catalog# Comments
70μm nylon filter( cell strainer) BD Biosciences 352350  
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) Invitrogen 14175 w/o CaCl2 and MgCl2
1x Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen 11095-080  
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma F0503 prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C
96-well flat well bottom TC plates Corning 3599  
Acyclovir Calbiochem 114798 prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C
Aphidicolin Calbiochem 178273 prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C
B-27 Supplement Invitrogen 17504-44  
Collagenase Sigma C2674 prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C
D-(+)-Glucose Sigma G6152 prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C
L-Glutamine Invitrogen 25030-081  
Laminin Sigma L2020 prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O
Leibovit’z L-15 media Invitrogen 11415  
Nerve Growth Factor Harlan Laboratories BT.5017 prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C
Neurobasal medium Invitrogen 12348  
Phosphonoacetic acid (PAA) Sigma P6909 prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P0899 prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Rat-tail collagen Millipore 08-115 Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O
Trichostatin A Sigma T8552 prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C
Trypsin 2.5% Invitrogen 15090-04  

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Citer Cet Article
Kobayashi, M., Kim, J., Camarena, V., Roehm, P. C., Chao, M. V., Wilson, A. C., Mohr, I. A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation. J. Vis. Exp. (62), e3823, doi:10.3791/3823 (2012).

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