Snabb bestämning av den termiska Nociceptiv tröskeln i diabetiska råttor

TNTs av möss och råttor bestäms med hjälp av inkrementella värmeplattan analgesi meter [iHPAM, IITC Inc. Life Science (Woodland Hills, CA)]. Utrustningen består av flera komponenter: en aluminiumplatta (10 x 20 cm) med värmesystemet under och ett plexiglas observationskammaren ovan, en värme kontroll enhet, programvara för datainsamling (IITC art.nummer Soft serien 8), en PC (persondator dator) och en fotpedal för fjärr start, stopp eller återställa kontrollen över enheten. Värmesystemet ger också start / stopp / återställning av uppvärmningen manuellt via en knappsats framför utrustningen. Den iHPAM kan ställas in till olika uppvärmning priser, standby / cutoff temperaturer.

1. Utrustning Set-up

1. Innan testning djur, Inspektera enheten visuellt för att bekräfta de valda uppvärmning priser t.ex. 6 ° C / min), inledande standby och Final Cut-off temperaturer (t.ex. 28 ° C och 55 ° C, respektive).
2. Kontrollera alla anslutningar. För att hålla elektronisk kopia av resultaten, måste enheten vara ansluten till en dator som kör Software Series 8. Alternativt kan papperskopior av resultaten skrivas ut via den seriella porten på enheten.
3. Testa utrustningen. Tryck på fotpedalen gång för att försäkra att programvaran serien 8 registrerar data: första vänteläge, slutliga cutoff temperaturer och tid i sekunder som krävs för att nå cut-off temperatur.
4. Som en ytterligare kontroll test kan utredarna inblandade i försöken att behöva uppleva enheten på sig själva. Dra tillbaka handen från metallplattan vid tidpunkten för smärtupplevelse (46-48 ° C) får varken skada på huden eller för att producera en senare obehag.
5. När enheten har ställts in och resultaten från stegen 1.3 och 1.4 redovisas de kan jämföras. Detta är bra för att upptäcka eventuella problem som skulle kunna kullkasta användningen av enheten. Till exempel skillnader mellan första standby / Final Cut-off Temperaturerna och den faktiska behandlingen av enheten, och / eller skillnader mellan temperaturerna som visas av apparaten och den faktiska plattan temperatur som krävs för handen dras tillbaka.

2. Testa normala djur

Antingen unga eller vuxna Wistar råttor [postnatal (p) ålder 21-25 dagar], eller möss (p21-25) för alla genetiska bakgrund eller kön kan användas. De möss som användes i våra experiment är av stammen C57BL/6J.

1. Kvällen innan experimenten som ska utföras, vänja djuren genom att placera sina burar på bänken där iHPAM är placerad. Två timmar innan du utför testerna slå på iHPAM att bekanta djuren med bakgrundsbrus enheten. Vid denna punkt kan iHPAM sättas upp och testades för att verifiera riktig funktion (se steg 1). Mat och vatten tillhandahålls ad libitum under hela testet, förutom när djuret är i observationskammaren (se Steg 2.1).
   Obs: Det är important inte att anta att förhållandena i laboratoriet i beteendeförsök styrs som standard. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt genetiska och miljömässiga faktorer som kan påverka resultatet av beteendestudier (över ^7).
2. Försiktigt placera en normal mus / råtta i Plexiglas observationskammaren ovanpå värmeplattan av enheten. Tillåta djuret att acklimatisera sig till den värmda ytan (inställd vid 28 ° C) till dess att djuret visar en bekväm beteende.
   Obs: Under detta villkor normala vuxna råttor visar en initial utforskande beteende, ibland stod upp mot locket observationen kammaren medan sniffning. Efter några minuter kan råttor visar tillfälliga anfall av grooming och en avslappnad beteende. Ibland låg råttor med en avslappnad kroppsställning (benägna förlängning) medan lättvindigt sniffning omgivningen. Normala möss är vanligen mer aktiva än råttor. Men möss visar en avslappnad undersökande beteende efter några minuter in observation kammaren. Det är exceptionellt ovanligt att följa antingen flyr beteenden (t.ex. hoppa, försöker fly från observationskammaren) eller defensiva attityder (t.ex. skrikande). Det är också viktigt att notera att möss kan kommunicera smärta från en mus till en annan ^8. Därför kan det vara viktigt att testmöss placerade i separata burar.
3. Placera speglar på baksidan av observationen kammaren, för att möjliggöra observationer vid alla vinklar. Ett stativ som håller en digital videokamera kan vara till hjälp för att bestämma den exakta tidpunkt då nocifensive (smärta undviker) beteende hade inträffat.
4. När djuret är bekväm i observationskammaren värma upp plattan genom att trycka på fotpedalen. När plattan temperaturen värms upp med en hastighet av 6 ° C / minut, normala djur uppvisar nocifensive beteende involverar antingen baktass * Vanligtvis temperaturer rasar 46 till 48 ° C ^3,5,9,10. Sålunda är djuret typisk borttagen från observerbaraation kammaren efter ca 3 minuter.
   Anm: Beaktande den typiska nocifensive gensvar på en råtta eller mus dvs baktass slickande under omskakning och / eller lyft, är tillräckligt för att avsluta den termiska stimuli. Detta uppnås genom att trycka på fotpedalen. I detta ögonblick registrerar programvaran plattans temperatur och plattan omedelbart kyls ner tills standby temperatur (28 ° C) har uppnåtts (~ 0,5 min). Denna temperatur, dvs är en som framkallar någon nocifensive reaktion betraktas som den skadliga värme tröskelvärde (TNT) av den normala (kontroll) djur.
   * Ibland, särskilt i möss, kan nocifensive beteende skadlig temperatur först observeras i en eller båda framtassarna (t.ex. slicka sittande), några sekunder innan hind-tassar. Emellertid är FORE-tass slicka en normal del av grooming beteende. Därför är endast baktass reaktioner bedömas. I tillfällen möss kan borsta sina baktassarna också. Men, normal grooming gör not varar mer än några sekunder, inte innebär intensiv slicka och vanligtvis slutar efter rengöring klorna.
5. Ta försiktigt bort djuret från plattan och placera den i sin respektive bur. Värmen tröskeln mätningen upprepas sedan för andra kontroll (normal) djur.
   Anm: TNTs kan bestämmas i ett enda djur med intervall av 1-2 minuter utan att avlägsna det djur från observationskammaren. TNT bestämningar på råttor eller möss kan upprepas flera gånger under flera dagar. Detta är särskilt användbart för att bestämma den genomsnittliga TNT av ett enskilt djur och dess variation med tiden.
6. TNT av kontrolldjur uttrycks som medelvärdet av tre eller flera tröskelvärden ± SEM.
7. Statistisk analys av erhållna data utförs för att jämföra olika behandlingsgrupper om möss eller råttor. Parametriska förfaranden inklusive analys av variansanalys kan lämpligen användas där data normalfördelade och där behandlingsgrupperna är homoskedastic, när dessa villkor har uppfyllts följande tillvägagångssätt kan tillämpas. Analys av varians följt av Newman-Keuls-testet för att detektera skillnader i multipla mätningar dvs, upprepade individuella TNTs med / utan behandling eller vid olika tidpunkter (t ex data i figur 3). Den parade Students t-test kan användas för att jämföra två datagrupper dvs TNTs före kontra efter läkemedelsbehandling, den oparade t-testet kan användas för att bestämma skillnader i TNT förändringar i läkemedels-behandlade vs bil-behandlade djur (t.ex. , data i figur 4).

3. Testa diabetiska djur

Streptozotocin (STZ)-inducerad diabetisk råtta är den vanligast använda djurmodell för att studera mekanismer för PDN och för att bedöma analgetiska läkemedel och terapier ^11,12. Råttor, som gjorts diabetiska genom en enda intraperitoneal dos av STZ (60 mg / kg) kan b.e testats för termisk hyperalgesi under 3: ^e veckan efter debut av diabetes ^11. Det är viktigt att notera att inte alla diabetiska råttor utvecklar PDN. Däremot kan djur som inte utvecklas hyperalgesi (~ 50%) kan lätt identifieras. I själva verket deras TNTs är lägre än normalt *.

* För att bestämma TNTs av STZ-diabetiska råttor, ° utgångsmaterial plattemperatur av 15 C i stället för 28 ° C används. Anledningen för dessa förändringar är att de flesta diabetiker djur med PDN förväntas vara hyperalgesiska ^2,11. Därför kommer de att ha lägre än normala skadliga värme trösklar (t.ex. <45 ° C).

1. En diabetisk råtta placeras i observationskammaren ovanpå testapparaten. Djuret får acklimatisera sig till plattans yta till dess att djuret visar en bekväm beteende.
   Notera: Normalt, inte en diabetisk råtta inte visa mycket av det normala beteendet. Diabetiska råttor är oftast hypoaktivt, slö, ofta visarbegränsade rörelser och långsamt grooming. Det är sällsynt att observera ställningar mot locket till observationskammaren. Efter några minuter kan diabetiska råttor bo lugnt i ett hörn av kammaren med diskret sniffning av omgivningen.
2. När diabetiker djuret är bekväm i observationen kammaren plattan värms upp som i steg 2,3 av diabetisk råtta kan uppvisa nocifensive beteende som innebär antingen bakom / FORE-tass. Detta händer vanligen vid icke-giftiga platta temperaturer (t.ex. <45 ° C), eller efter inte mer än 5 minuter i kammaren med 6 ° C / minut temperaturökning.
   Obs: nocifensive svar på en ung vuxen diabetisk råtta skiljer sig inte från den för en normal råtta. Dock den lägsta temperaturen framkalla ett sådant beteende avsevärt sänkas.
3. Se Steg 2,4
4. Medelvärdet av mer än tre tröskelvärden i dagen för experimentet uttryckt som ° C ± SEM anses vara skadliga värmen tröskeln till diabetic djur.
   Obs: En liknande paradigm till ett förklarat för normal eller diabetiska råttor kan följas för att bestämma den termiska anti-nocifensive effekt av analgetika på värme trösklar.

4. Testning Analgesi

De anti-nociceptiva egenskaper hos läkemedel (t ex analgetika) samt bestämning av farmakologiska parametrar såsom den minsta effektiva dosen kan lätt erhållas genom användning av stegen som förklaras ovan. Det förutspås att lämpliga doser av ett smärtstillande ges till råttor / möss avsevärt skulle öka sina TNTs. Detta är särskilt känslig i djur med termisk hyperalgesi ^3. För att undvika snedvridning i tolkningen av resultaten måste utredarna är involverade i beteende observationen av en djurgrupp vet inte eller vara medveten om djuren hade behandlats eller inte. Vidare kan läkemedel som injiceras av observatören beredas av en annan utredare och märktaA, B, C, etc. Dosering tillhandahålls i en utskrift, att enskilda doser per identifierade djur.

Beroende på det läkemedel som testas, kan olika doser av en potentiell analgetikum administreras till normala eller diabetiska djur 5-15 min före beteendetester. Lämpliga kontroller måste ingå (dvs. åldersmatchade djur injicerade med enbart vehikel och / eller diabetiska råttor utan PDN) och testades med användning av identiska betingelser (t.ex. samma starttemperatur av plattan). Kroniska effekter av läkemedel kan testas också.

5. Representativa resultat

Den lägsta temperatur för framkalla nocifensive reaktioner i antingen baktass av unga vuxna normala icke-behandlade råttor eller möss bestämdes följande åtgärder 2-1 till 2-6. Såsom visas i figur 1, TNT av normala unga vuxna råttor och möss var 47,2 ± 0,2 ° C och 47,5 ± 0,5 ° C respektive.

Vi har observed varken betydande dagliga variationen av individens TNTs (Figur 2A) eller betydande förändringar av TNTs mellan individer i samma ålder (Figur 2B). TNT skillnader på grund av kön observerades inte (visas ej).

TNTs hos unga vuxna STZ-diabetiska råttor bestämdes på ett liknande sätt som för normala råttor (steg 3.1 och 3.3). Emellertid var utgångsmaterialet plattans temperatur inställd på 15 ° C i stället för 28 ° C. Den nocifensive beteende STZ-diabetiska råttor utvärderades minst tre gånger i en individ och i en daglig sätt börjar elva dagar efter STZ injektion. Såsom visas i figur 3, en signifikant minskning (p <0,01) i TNT av STZ-diabetiska råttor visar sig två veckor efter STZ injektion. Medelvärdet TNT av STZ-diabetiska råttor var 45,6 ± 0,1 ° C (n = 16, poolade värden från dag 14-23).

Diabetiska råttor uppvisar betydligt lägre TNT än Normal ansågs ha PDN. Dessa råttor användes för att testa de akuta anti-nociceptiva egenskaper hos en analgetisk (förening A). TNTs bestämdes i normala och diabetiska råttor injicerade med antingen en enda dos av förening eller vehikel enbart fem minuter före testet. Såsom visas i figur 4, en enda intra-peritoneal dosen av föreningen ökade signifikant TNTs av diabetiska råttor jämfört med råttor behandlade med enbart vehikel (45,6 ° C vs 47,6 ° C, respektive). Den anti-nocifensive effekten av förening A observerades också i normala råttor, även signifikant (p <0,01), var det mindre uttalad (47,4 ° C vs 48,0 ° C, respektive).

Figur 1. Fastställande av TNTs av normala unga vuxna råttor eller möss: De TNTs av unga vuxna råttor (p21-24) eller möss (P20-21) testades i iHPAM följa stegen above. Totalt 12 råttor och 25 möss testades. Mätningarna utfördes under flera dagar och resultaten slogs samman. Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM. Den lägsta och högsta TNT värdena registreras i dessa råttor var 46,2 ° C och 48,6 ° C respektive. I fallet med möss, var de maximala och minimala TNT registrerade värdena 48,8 ° C och 44,9 ° C respektive.

Figur 2. Age-beroende av TNTs hos råttor och möss: A) avsatt är TNTs fyra normala råttor (n = 4) på 21 dagar gamla bestämmas minst tre gånger dagligen under 5 dagar B) TNTs av möss kullsyskon fastställas en gång i anges. åldrar. Siffrorna på toppen av varje bestämning punkt representerar antalet använda kullsyskon.

Figur 3. Diabetiska råttor blir hyperalgesiska 3 har vieks efter debuten av diabetes: TNTs av sex (n = 6) åldersmatchade unga vuxna STZ-diabetiska råttor bestämdes varje dag med början 11 dagar efter induktion av diabetes. Visas är dagliga medelvärden TNT (medelvärde ± SEM). Diabetes TNTs fastställs mellan 11-13 dagar efter STZ injektion var inom det normala intervallet (röd linje). Två veckor efter STZ injektion TNTs minskade signifikant till 45,1 ± 0,4 ° C, (p <0,05).

Figur 4. Akuta anti-nocifensive effekterna av förening B i STZ-diabetiska råttor. Unga vuxna normala råttor (blå grupp n = 12) och åldersmatchade STZ-diabetiska råttor hyperalgetiska (grön grupp n = 6) testades i iHPAM efter intraperitoneal injektion av vehikel (mörka staplar) eller förening A (lätta staplar). Medelvärdet TNT ± SEM för varje behandlingsgrupp (vehikelkontroll eller förening A-behandlad) visas. Asterisker betecknar statistiska skillnader(P <0,05).

I likhet med den klassiska varma plattan test för att kvantifiera termisk hyperalgesi ^4,13, beskrev analysen av nociception här tillåter ett snabbt och tillförlitligt sätt att kvantifiera nocifensive beteende hos råttor och möss. I motsats till klassiska testet är den inkrementella värmeplattan metoden icke-invasiv och praktiskt taget utan stress. Även om vissa hålla är nödvändig för att utföra testet (dvs djuret måste vara i observationskammaren) är råttor eller möss vana vid att liknande områden (t.ex. bostadsområden burar).

Under de beskrivna förhållanden visade normala unga vuxna råttor och möss nocifensive beteenden vid temperaturer kring 47 ° C. Även om dessa trösklar är något högre än de som rapporterats av andra forskare ^3,5,13, ​​våra resultat är i överensstämmelse med den termiska nociceptiva tröskeln 46-48 ° C observerats hos människa ^14, apor ¹⁵ och andra djurmodeller ^10. Den diffeCES i TNTs från våra studier och de som publicerats ^3,5,13 kan vara relaterad till ålder de använda djuren. I själva verket, termiska nociceptiva trösklar är högre hos unga vuxna råttor än råttor som är 4 veckor gamla eller äldre ^16.

Sammanfattningsvis följa stegen ovan, kan den inkrementella värmeplattan analgesi meter bestämning av termo-nociceptiva tröskelvärden för normala / diabetiska råttor eller möss på ett reproducerbart sätt. Vidare, vid administrering av analgetika, särskilt till hyperalgetiska råttor, kan en ökning av TNT vara statistiskt detekteras. Denna metod kan vara användbar att sålla potentiella analgetika hos möss och råttor under förhållanden av minimal stress.