Alto y Bajo Rendimiento pantallas con nematodos- Meloidogyne spp.</em

1. Crecimiento de las plántulas de tomate en macetas y bandejas Para los ensayos de marihuana, semillas de plantas de tomate en una sola olla en un suelo rico en materia orgánica, como mezcla de sol. Mantener en un invernadero a 22-28 º C. Después de la germinación, fertilizar una vez a la semana con Miracle-Gro. Unas dos semanas después de la germinación, en los dos verdadera hoja de etapa, el trasplante de forma individual las plantas de semillero en macetas (10 cm de diámetro y 17 cm de profundidad) con suelo de arena estéril que contiene un 90% de arena y 10% mezcla orgánica. Añadir Osmocote fertilizante de liberación lenta y mantener en un invernadero a 22-28 ° C durante dos semanas. Continuar para fertilizar las plantas una vez por semana con Miracle-Gro. Para pantallas de alto rendimiento, las semillas de las plantas directamente en las bandejas en el suelo arenoso, cubrir la bandeja con papel plástico hasta la germinación y mantener que el anterior. Después de la germinación, agregar fertilizante de liberación lenta Osmocote y fertilizar una vez a la semana con Miracle-Gro. 2. Caupí crecimiento de las plántulas en bolsas SEEDS son o bien germinaron en una placa de Petri, revestida con varias capas de papel Kimwipe, y se transfieren individualmente a bolsas o coloca directamente en la ranura de papel de la bolsa y se germinaron. Coloque las bolsas en una carpeta de plástico colgando, dos por cada carpeta, y organizar las carpetas en un bastidor en posición vertical. Coloque el bastidor en una cámara controlada entorno mantenido a una temperatura de 25-28 ° C y 16 h luz / 8 h oscuridad ciclo. Bastidores también se puede mantener en un invernadero, pero requieren una lámina o cubierta de papel rígido colocado sobre el bastidor en ambos lados de los tallos de las plantas, para reducir el potencial de contaminación por hongos. Las bolsas de agua una o dos veces por día con agua de ósmosis inversa. Alrededor de 10 a 14 días después de la siembra, cuando un sistema radicular adecuado, con puntas de las raíces terciarias ha desarrollado (Figura 1), las plántulas están listas para la inoculación. 3. La extracción de huevos de nematodos Extracción de correoSGG de las raíces infectadas se modifica a partir de un protocolo desarrollado por Hussey y Barker (1973). Tres o cuatro días antes de la inoculación de nematodos, extraer nódulo de la raíz huevos de nematodos de las raíces de tomate infectadas. Antes de iniciar la extracción de huevos, lave el área de trabajo a fondo con agua caliente para evitar la contaminación. También lave en agua caliente una. Licuadora, dos cubos, un soporte de malla de alambre, un mazo de goma, tres tamices de 425, 90 y 25 m de apertura, una probeta graduada y unas tijeras Apilar los tamices de arriba a abajo en el siguiente orden: 425, 90 y 25 m de apertura. Los huevos se recogerán en el tamiz 25 micras en la parte inferior. Coloque los tamices sobre una rejilla metálica apoyada en el fregadero. Coloque una cubeta debajo de la malla de alambre para recoger la solución de ejecución a través. Cortar la parte superior de la planta infectada (s), utilizados como la fuente del inóculo, y desechar. Retire con cuidado la planta de la maceta. Lavar las raíces por inmersión en un cubo de plástico lleno de agua. Aclarar las raíces más en ejecutarseNing agua hasta que las partículas del suelo son arrastradas desde las raíces. Cortar las raíces con tijeras en trozos pequeños. Deshágase de la raíz principal. Coloque las raíces cortadas de una sola planta en un frasco grande de plástico con tapa, agregar suficiente solución de lejía al 10% para cubrir las raíces y cierre la tapa. Agite bien el frasco que contiene las raíces de 2 min. Abra el frasco y vierte las raíces en el tamiz superior y lavar con una manguera conectada a una boquilla de nebulización. Lavar bien hasta que todo el olor a lejía se ha ido. Utilice un martillo para insertar las caras de los tamices para evitar la obstrucción de los poros del tamiz. Retire el tamiz superior y enjuagar los restos en el segundo tamiz. Eliminar el segundo tamiz y recoger la basura fina, que incluye los huevos, desde el tamiz pasado. Con una corriente suave de una botella de agua, mover los escombros a un lado del tamiz. Recoger la basura y los huevos en un recipiente limpio con una cantidad mínima de agua. Tamizar una vez más el agua recogida en elcubeta a través del tamiz 25 micras para recoger los huevos que pueden haber escapado. Enjuague bien con agua y se acumulan en el mismo vaso. Desechar los restos de la planta desde el tamiz superior y lavar a fondo los tres tamices con agua a presión. No toque la parte de malla de los tamices, ya que puede distorsionar el tamaño de los poros. 4. Los huevos para incubar de nematodos Línea de una canasta de metal limpio, con unas pocas capas de papel Kimwipe y cabe en un plato de Petri de vidrio. Permitir una distancia de 1 cm entre la parte inferior de la cesta y el plato. Verter los huevos de nematodos extraídos en el papel en el cesto de alambre. Añadir suficiente líquido de modo que la parte inferior de la cesta de alambre toca la superficie del agua, pero no está sumergido en agua. Cubra la parte superior con una tapa de plástico. Cada día visita para la evaporación de agua y añadir algo de agua en la placa de Petri de modo que el fondo de la cesta toca el agua. Esto evitará que los huevos de la desecación. Cada dos días, recogerá el water que contiene los J2S de las placas de Petri en un vaso de precipitados. Si no se utiliza inmediatamente, airear el inóculo recogido a temperatura ambiente usando un suministro de aire o de laboratorio de aire generada por una bomba de acuario. Utilizar el inóculo celular dentro de 2 días. J2S se puede recoger de la eclosión establecido durante un período de 6-8 días. 5. Infección de las raíces de tomate en macetas o bandejas y evaluación de la infección Utilizar tres alícuotas de los nematodos recogidos para contar el número de J2S en una diapositiva o plato contando, calcular el promedio y determinar el volumen deseado para la inoculación. Normalmente se utilizan J2S 3000 por planta en macetas y 500 J2S para las plantas cultivadas en bandejas de plántulas. Agitar el inóculo en una placa de agitación magnética a baja velocidad. Antes de inocular las plantas, asegúrese de que el suelo está húmedo pero no mojado también. Para la inoculación olla, hacer tres agujeros alrededor de la mitad de la olla de profundidad en la arena alrededor de cada sistema de raíces de tomate con un lápiz (Figura 2 </strong>). Inocular cada planta mediante la entrega de los J2S en los tres agujeros usando una pipeta. Después, cubrir los agujeros. Para las pantallas de alto rendimiento en las bandejas, utilice una aguja modificada punta sellada con agujeros en los lados pegados a una punta de pipeta de 5 ml a lo largo de un pipeteador (Figura 3) para entregar los J2S en el suelo. Alternativamente, los nematodos se puede enviar como en el paso 5,3. Mantener las plantas en un invernadero a 24-27 ° C durante seis a ocho semanas. Continuar para fertilizar dos veces al mes con Miracle-Gro. Para la evaluación de la infección, retirar con cuidado las plantas de las macetas y lavar las raíces (como se describe en el paso 3,3). Mancha de las masas de huevos azules, sumergiendo las raíces en 1 mg / L erioglaucine, durante 15 minutos. Lavar las raíces en agua y evaluar contando las masas de huevos manchados en el sistema de raíz individual. Una lupa de mesa de iluminación se puede utilizar para ayudar a visualizar las masas de huevos. Si las plantas apantallados son necesarios para g másLos estudios enetic, no corte la parte superior antes de lavar las raíces para su evaluación. Después de la tinción y recuento de las masas de huevos, trasplantar las plántulas en suelo orgánico, podar las copas en gran medida a reducir la transpiración, y mantener en un invernadero. 6. Caupí infección de las raíces en bolsas y evaluación de la infección Contar el inóculo de nematodos y se agita en una placa de agitación magnética como se describió anteriormente. Eliminar las bolsas de las carpetas colgantes y colocar en una superficie horizontal. Inocular cada bolsa con 1500 J2S en 5 ml. Levante la cubierta de plástico de la bolsa y distribuir los nematodos uniformemente sobre la superficie de las raíces. Mantenga las bolsas en posición horizontal durante 24 horas después de la inoculación, cubierto con papel oscuro para evitar la luz, a continuación, volver a las carpetas que cuelgan en la cámara de crecimiento. Riegue las plantas cuando sea necesario, una o dos veces al día, con Hoagland medio-concentración de la solución (Hoagland y Arnon, 1950, Tabla 1 </> fuerte) hasta una respuesta al fertilizante se observa, reverdecimiento follaje típicamente mejorada y crecimiento de los brotes más vigorosa. Por lo general, las plantas se riegan con Hoagland de fuerza media de 3 días seguidos. Después, mantenga las bolsas húmedo con agua. Aproximadamente 30 días (rango 28-35 días) después de la inoculación, infusión de cada bolsa con alrededor de 10-20 ml de 75 mg / L erioglaucine. Mantener las bolsas inundadas con el colorante en una posición horizontal durante la noche. Vacíe las bolsas y evaluar los sistemas de raíces, contando las masas de huevos en una lupa mesa iluminada. Si las plantas examinadas son necesarios para posteriores estudios genéticos o el trabajo de reproducción, tire con cuidado las raíces del papel, el trasplante en suelo orgánico en macetas y mantener en un invernadero. 7. Los resultados representativos Las etapas apropiadas de las plantas de tomate y caupi para inoculaciones de nematodos de los dos sistemas descritos se muestra en las figuras1 y 2. Además, los ejemplos de bien infectadas raíces de tomate y caupi se muestran en las figuras 4 y 5. Como en la mayoría de las pantallas de resistencia a enfermedades, es aconsejable utilizar al menos 6-10 plantas por genotipo para la inoculación de nematodos para calcular el promedio de la tasa de infección. La variación en la infección por nematodos entre las plantas, del mismo genotipo, se puede reducir mediante el uso de tamaño de la planta uniforme y la cantidad exacta y la entrega de inóculo. El uso de bandejas y bolsas de crecimiento permite el cribado de los cientos de miles de plantas en un espacio pequeño crecimiento. Bolsas de crecimiento también permiten rápida y eficiente evaluación no destructiva de infecciones por nematodos agalladores sin necesidad de raíces de lavado (Figura 4). Figura 1. Un dos semanas de edad planta caupi crecido en una bolsa y listo para agallador NEMATode la inoculación. Figura 2. A tres semanas de edad, planta de tomate preparada para la inoculación nematodo agallador. Figura 3. Una aguja modificado y punta de la pipeta utilizada para la inoculación de alto rendimiento de los nematodos. La parte inferior de una aguja se selló y tres conjuntos de agujeros se perforaron en la aguja utilizando un rayo láser. Entonces, la aguja modificado fue pegado a una punta de pipeta de 5 ml. Figura 4. Un sistema de raíces de tomate infectadas con el nematodo agallador. Figura 5. Un sistema de raíces de caupí, con masas de huevos teñidos con erioglaucine 30 días después de la inoculación crecido a28 ° C.