Вовлечение рост дендритов в культуре симпатических нейронов
Summary
Мы опишем протокол для использования костных морфогенетических белков-7 (BMP-7) или Матригель выборочно стимулировать рост дендритов в первичных симпатических нейронов в отрыве от верхних шейных ганглиев (SCG) перинатальной крысы.
Abstract
Форма дендритных беседки определяет общее синаптической вход нейрона может получить 1-3, и влияет на типы и распределение этих входов 4-6. Измененные формы рост дендритов и пластичности, связанные с нарушениями неврологического функции в экспериментальных моделях 7, и, как полагают, способствует клинические симптомы наблюдаются и в нервной 8-10 нарушений и нейродегенеративных заболеваний, 11-13. Такие наблюдения подчеркивают функциональное значение именно дендритные регулирующих морфологию, и предполагают, что определение механизмов, которые контролируют рост дендритов будет не только способствовать пониманию того, как нейронные связи регулируются во время нормального развития, но также может дать представление о новых терапевтических стратегий для различных неврологических заболеваний.
Механистические исследования дендритных рост будет значительно облегчается благодаря наличию офа модель системы, которая позволяет нейронам экспериментально перешли от состояния, в котором они не распространяются на дендриты, в котором они разработать дендритных беседки сравнима с их коллегами в естественных условиях. Первичные культуры симпатических нейронов в отрыве от верхних шейных ганглиев (SCG) перинатальной грызунов обеспечить такую модель. При культивировании в определенной среде в отсутствие сыворотки и ганглиозные клетки глии, симпатических нейронов распространяется единый процесс, который аксонального, и это однополярный состояние сохраняется в течение нескольких недель или месяцев в культуре 14,15. Тем не менее, добавление или костные морфогенетические белки-7 (BMP-7), 16,17 или 18 Матригель питательной среды вызывает эти нейроны расширить несколько процессов, которые отвечают морфологические, биохимические и функциональные критерии дендритов. Симпатических нейронов в отрыве от SCG перинатальной грызунов и выросли при определенных условиях однородной популяции нейронов 19которые отвечают равномерно дендритов способствующих деятельности Матригель, BMP-7 и других БМП из decapentaplegic (ДПП) и 60A подсемейства 17,18,20,21. Важно отметить, что Матригель и БМП-индуцированных дендритных формирование происходит при отсутствии изменений в выживаемости клеток или рост аксонов 17,18.
Здесь мы опишем, как настроить диссоциированных культурах симпатических нейронов, полученных из ГКО перинатальной крысы, так что они отвечают на избирательный дендритов, содействие деятельности Матригель или БМП.
Protocol
Discussion
Преимуществами этой модели можно отнести: (а) культур состоят из однородного населения симпатических нейронов лишенной других типов клеток 17,23, (б) фактор роста требований симпатических нейронов хорошо установлена, которая позволяет использовать определенной среде, а также ряд ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансирование от Национального института здоровья (гранты R21 и R01 NS45037 ES014901).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Glass coverslips | Bellco | 1943-10012 | 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass |
| Bent tip pipets | Bellco | 1273-50003 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899-100MG | Stock solution 1 mg/ml |
| Distilled water | Gibco | 15230 | |
| Fine forceps Dumont no. 4 and 5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-30 11241-30 | |
| 20-gauge needles | Becton Dickinson | 305176 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenase | Worthington | 4176 | 1 mg/ml |
| Dispase | Roche | 04942078001 | 5 mg/ml |
| Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM Low glucose | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulin/Transferrin/ Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Fatty-acid free BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Harlan Bioproducts | 5017 | |
| Ham F-12 nutrient medium (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Avoid repeated freeze-thaw cycles |
| BMP-7 | R&D Systems Curis, Inc. | 345-BP BMP7-07H | BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Mouse anti-rat MAP2 antibody | Sternberg Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Mounting media | Prolong Antifade kit Molecular Probes | P7481 |
Table 1. Materials.
References
- Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. . The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).
- Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
- Purves, D. . A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).
- Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
- Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
- Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
- Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
- Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
- Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
- Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
- de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
- Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer’s disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
- Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
- Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
- Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
- Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
- Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).
- Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
- Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).
