Transformação e Cercarial In vitro Cultivo de Schistosoma mansoni Esquistossômulos

Medidas de segurança: Cercárias do S. mansoni pode penetrar diretamente na pele sem a necessidade de um corte ou poros, e causar a doença crônica da esquistossomose. S. mansoni é um nível de biossegurança 2 organismo, portanto, equipamento de proteção individual e medidas de segurança apropriadas devem ser seguidas quando se trabalha com cercaria infecciosa. A maioria dos equipamentos necessários para crescer e transformar schistosomes é padrão, com uma chave poucas exceções indicado na tabela ao final do protocolo. Todo o trabalho cercarial deve ser feito em uma sala isolada. Esquistossômulos devem ser cultivadas em um estéril capa de biossegurança, aprovado. Duas camadas de borracha nitrílica ou luvas de látex devem ser usadas, bem como uma bata de laboratório, um par de sapatos impermeáveis, calças sem furos ou rasgos, e mangas de protecção impermeável para seus pulsos e braços. Em caso de derrame acidental, pulverizar imediatamente a área contaminada com etanol 70% ou água sanitária a 10%, esfregando vigorosamente se em sua pessoa. Isso vai ser suficiente para desativar o parasita, mas todas as possíveis infecções devem ser relatados e levada a sério. Embora esquistossômulos não são inatamente infecciosa, diretrizes institucionais variam, e devem ser consultadas para determinar se BSL2 precauções são necessárias durante as fases da vida não-infecciosa. Desinfectar todas as superfícies que entram em contato com qualquer substância potencialmente infecciosos após o experimento é realizado e descarte de resíduos em um recipiente aprovado biohazard. NOTA: caixotes Cubra snail host 1 a 2 dias antes da queda e proteger da luz 1. Colheita cercárias a partir do host caracol Encher um copo limpo e livre de 500mL detergentes metade cheio com água destilada atingir a temperatura ambiente. Se trabalhar com caracóis hospedeiro infectado com miracídios em datas diferentes, use um copo separado para cada data de infecção (Isto é particularmente importante se os caracóis será reutilizado para futuros experimentos). O tamanho do copo também pode ser menor dependendo da experiência do usuário. Coletar caramujos infectados hosts que você deseja galpão e depositá-los cuidadosamente no copo com um peixe de aquário padrão net e pinças de uso geral, conforme necessário. Copo lugar em um derramamento de emergência bandeja de aproximadamente 8 a 12 polegadas sob uma fonte de luz incandescente. Deixe repousar por 1-2 horas sob a luz. Cercárias sair do caramujo hospedeiro quando expostos à luz brilhante. Cuidadosamente filtrar caracóis a partir da mistura cercárias. Tomar precauções de segurança extra, como mistura é altamente infecciosa. Lembre-se, cercárias podem penetrar diretamente da pele humana! Substituir mistura sob fonte de luz para cerca de 15 minutos, permitindo que qualquer questão dos resíduos de partículas para resolver. Transferência de cercárias em um erlenmeyer limpo usando uma pipeta, evitando os destroços no fundo do copo. Colocar o balão em aproximadamente um ângulo de 45 ° no gelo no escuro por 45-60 minutos, permitindo cercárias para resolver em um canto. Use uma pipeta de 50 mL para remover 75 a 90% do sobrenadante e depositá-lo no copo contendo lixívia 10% ou etanol 70%, tendo o cuidado de não deixar pingar gotas de água contendo cercárias da pipeta. Agitar o erlenmeyer contendo cercárias suavemente para voltar a suspender as cercárias em solução. Use uma pipeta para transferir a amostra para 50 tubos estéreis ml. Coloque os tubos novamente no gelo por 20 minutos no escuro. Cercárias vai resolver para o fundo do tubo no escuro. 2. Transformação manual de cercárias em esquistossômulos Antes de começar: Faça RPMI 1640 completo (RPMI, 5% de soro fetal bovino, 1X Pen / Strep) e quente a 37 ° C. (É fundamental que o soro fetal bovino utilizado foi inativada pela incubação a 56 ° C durante 1 hora como schistosomes pode ser sensível para complementar). Em uma capa de risco biológico, remover o sobrenadante até 5 a 10 ml de solução em cada cônico de 50 ml utilizando uma pipeta ou outro dispositivo de vácuo. Anexar um calibre 22 double-ended, luer lok emulsificante agulha para uma seringa de tamanho adequado. Tirar lentamente a mistura para dentro da seringa. Coletar cercárias de todos os tubos de 50 ml em uma seringa. Esteja atento de gotejamento. Cuidadosamente por sua vez seringa sobre como que o fim agulha não acoplada é para cima. Anexar outra seringa para este lado da agulha emulsificante. Passe a mistura através da agulha de um total de 40 vezes (20 vezes ida e volta) para transformar o cercárias. Posição das seringas na vertical de tal forma que a mistura está contida na seringa inferior e superior é a seringa vazia. Retire a seringa top e desinfectar em etanol 70%. Gota a gota depósito mistura em um prato limpo alta 100 milímetros x 50 milímetros murada pirex ou prato de cristalização. Desinfectar agulha e seringa em Etanol 70%. Adicionar 37 ° C RPMI 1640 completo de mídia de modo que ainferior da placa de Petri é completamente coberto, como se derramando um prato de caldo Luria. Agite cuidadosamente para coletar esquistossômulos no centro da placa de Petri. Evitar respingos. Nota: Pode ser útil para desligar a luz do exaustor para esta etapa a mais adequada visualizar os esquistossômulos no centro. Imediatamente depósito esquistossômulos concentrada em uma nova placa de cultura de células de 12 bem assim usando um conta-gotas estéril. Repita 2.9 e 2.10 até esquistossômulos não estão mais presentes no centro do prato (cerca de 10 vezes). Depósito cada recolha subsequente em uma bem fresca. Encher cada poço até metade (~ 1,5 mL) pré-aquecido com a mídia RPMI completo. Visualize em um microscópio invertido para verificar a presença dos esquistossômulos e ausência de cercárias. Crescer a esquistossômulos em uma incubadora de CO 2 set a 37 ° C e 5% CO 2. 3. Resultados representativos: Transferência pendente de esquistossômulos transformados em meios de cultura, visualização sob um microscópio de campo brilhante invertido (Ver tabela de equipamentos, por exemplo) deve render uma imagem semelhante à Figura 1, em que apenas esquistossômulos transformados estão presentes no poço. Contaminantes potenciais poderiam incluir cercárias intacta, caudas cortadas cercárias, ou outros detritos. Se nenhum microscópio invertido estiver disponível, um microscópio padrão ou mesmo um escopo dissecção será suficiente para visualizar os esquistossômulos. Note que este procedimento nem sempre transformar 100% de cercárias. Figura 1: esquistossômulo Transformado Figura 2: cercárias e Tails Severed