Cut-loading: uno strumento utile per esaminare fino di accoppiamento Tracer Junction Gap tra i neuroni della retina

1. Intatti i preparativi retina neurale per pesci rossi, topi e conigli Eseguire tutte le seguenti operazioni, comprese quelle descritte nella "2) Cut-loading", sotto costante ambiente (sfondo) illuminazione. Si prega di notare che ai fini del presente protocollo, le procedure sono descritti come eseguita nel buio costante (cioè sotto molto scuro (ad esempio "scotopica") condizioni ≤ 0,0001 lux), utilizzando occhiali per la visione notturna a infrarossi, ma gli altri livelli di intensità maggiore di costante illuminazione ambientale può essere invece utilizzata per determinare l'effetto di altri livelli di illuminazione ambientale sull'accoppiamento gap junction tracciante. Dark-adattare la sperimentazione animale (pesci rossi, mouse o di coniglio) per almeno 1 ora prima dell'intervento chirurgico. Come descritto in precedenza 7, profondamente anestetizzare pesci rossi mettendoli in tricaine metanosolfonato (MS222, 150 mg / L di pesci d'acqua tamponata (bicarbonato di sodio contenenti) serbatoio), e profondamente anestetizzare topi con ketamina (100 mg/ Kg, ip) e rompun (10 mg / kg, ip). Profondamente anestetizzare conigli con uretano (dose di carico: 2,0 g / kg, ip) e anche usare l'anestesia locale intraorbital (2% Xylocaine), come descritto in precedenza 8. Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono la cura e l'uso di animali deve essere effettuata conformemente alle linee guida federali ed essere esaminato e approvato dalla locale università e la cura degli animali comitati uso. (Nota:. Negli esperimenti descritti qui, tutte le procedure sperimentali che coinvolgono la cura e l'uso di pesce, topi e conigli sono stati eseguiti in conformità con le linee guida NIH e sono stati esaminati e approvati da Ohio State Cura degli animali dell'Università istituzionale e Comitato Usa) Per i pesci, topi e conigli, a seguito di enucleazione, rimuovere la parte anteriore di ogni bulbo oculare. Poi, posto un pezzo di carta da filtro in cima alla parte posteriore dell'occhio ed invertire la carta da filtro e l'occhio, in modo che la carta da filtro si trova sotto la parte posteriore dell'occhio. Quindi, utilizzando beneforcipe sezionare la retina neurale intatta dalla parte posteriore dell'occhio con delicatezza peeling via dell'epitelio pigmentato / coroide / sclera, che sono attaccati l'uno all'altro, dalla retina neurale, che è collegato alla carta da filtro. Poiché si tratta di fatto, tagliato il nervo ottico con sottile molla forbici. La retina neurale, orientato fotorecettori rivolta verso l'alto, ora dovrebbe essere allegato alla carta da filtro e separato dal resto dell'occhio. 2. Cut-loading Immergere la retina in una soluzione ossigenata Ringer (Tabella 1) in un 6-pozzetti (~ 5 mL / pozzetto) per 30 minuti in ambiente costante (sfondo) illuminazione (ad esempio sotto molto scuro (ad esempio "scotopica") condizioni) con o senza un test di droga. Mantenere la retina pesce in ossigenato (5% di CO 2 / 95% O 2) bicarbonato-based di Ringer a 22 ° C, tenuta il 6-pozzetti con parafilm e mantenere la retina topo e di coniglio a 36 ° C in un CO 5% 2 / 95% O <sub> 2 incubatrice. Quando un farmaco di prova, dovrebbe essere presente durante tutte le fasi successive fino fissazione Preparare la soluzione tracciante (tipicamente 100 mL), sciogliendo neurobiotin (0,5%), una molecola biotinilato, in soluzione di Ringer subito prima di tagliare attraverso la retina. Si noti che lo 0,5% rodamina destrano (alto (> 10.000) MW) può essere aggiunto alla soluzione. Grazie al suo elevato peso molecolare, rodamina destrano non attraversa giunzioni gap e solo le cellule etichette che sono state danneggiate dal taglio. Come mostrato in fig. 3, questo è un modo utile per distinguere le cellule che si sono accumulate neurobiotin perché sono stati feriti, da quelli che hanno accumulato il tracciante per diffusione attraverso giunzioni gap. Posizionare la soluzione neurobiotin su un vetro (o plastica) capsula di Petri, toccare la carta da filtro, a cui è collegata la retina, su un tovagliolo di carta per rimuovere l'eccesso Ringer, immergere una lama di rasoio (o altro lama tagliente) nella soluzione neurobiotin e iln un taglio radiale attraverso la retina e la carta da filtro. Se si preferisce, distanziali può essere utilizzato in modo che il taglio è fatto attraverso la retina, ma non la carta da filtro. Il taglio deve essere orientato perpendicolarmente alla superficie della retina. Immergere la lama nella soluzione neurobiotin nuovo e tagliare la retina una seconda volta. Ripetere questa operazione fino a 4 tagli al retina (vedi fig. 1). Utilizzare un microscopio da dissezione quando tagli rasoio tramite mouse e altri piccoli retine. Come mostrato in fig. 1, immergere la retina di nuovo nel medio Ringer fresco, con o senza droga test, con un 6-pozzetti (5 ml Ringer / pozzetto). Incubare la retina per 15 minuti per consentire il carico e diffusione. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con media Ringer fresco, con o senza droga test. Fissare la retina con 4% paraformaldeide in tampone fosfato 0,1 M (PBS, pH 7,4) per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare con 0,1 M PBS notte a 4 ° C. Il giorno seguente, reagire with 2% streptavidina-Alexa 488 (concentrazione finale 10 mg / mL) in PBS 0,1 M + 0,3% Triton X-100, e mantenere una notte a 4 ° C. Lavare tre volte per 10 minuti ciascuno con 0,1 M PBS a RT In PBS, staccare la retina dalla carta da filtro e poi, usando un pennello fine, luogo della retina, fotorecettori-orientato verso l'alto, in una diapositiva. Delicatamente il montaggio di media Vectashield montaggio (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Scatta foto con un microscopio confocale a scansione laser (per esempio, Zeiss 510 META) allo stesso ingrandimento, la risoluzione e le impostazioni per ogni condizione sperimentale, in modo da poter confrontare gli effetti delle diverse condizioni sperimentali (farmaci di prova per esempio, condizioni di illuminazione) sul grado di gap di giunzione tracciante di accoppiamento (Fig. 2A-C e fig. 4A-C). Anche se una sola immagine può contenere tutte le cellule etichettate, si consiglia di raccogliere un Z-Stack della zona di interesse e comprimerla in un unicoimmagine. 3. Quantificazione del tracciante giunto con ImageJ Nel browser di immagine LSM, aprire l'immagine, fare clic su Esporta e salvare l'immagine come TIF-16 bit non compresse dei file. Barra di scala dovrebbero essere inclusi in questa immagine TIF. Utilizzando il software ImageJ NIH, misurare l'intensità di fluorescenza di Alexa-488-etichettati neurobiotin a basso ingrandimento immagini di tutto il montaggio retine. Aprire il file TIF utilizzando il software ImageJ e quindi disegnare una linea retta corrispondente alla barra della scala. Vai a ANALIZZARE, SET SCALA e immettere la distanza conosciuta e unità di lunghezza, quindi fare clic su OK. Ora i risultati delle misurazioni possono essere presentati in unità calibrate, come ad esempio millimetri. Selezionare l'area di interesse utilizzando lo strumento selezione rettangolare. Il picco di fluorescenza dovrebbero essere posizionati al bordo sinistro della selezione. Assicurarsi che non vi è alcun segnale di fluorescenza vicino al bordo destro. In caso contrario, ruotare l'immagine attiva (IMAGE, poi ruotate). CliccareANALIZZARE e PLOT PROFILO. Si dovrebbe vedere una curva con un decadimento esponenziale da sinistra verso destra. Clicca COPIA nella finestra pop-up e incollarlo in Excel. Ora si vedono due colonne che mostra la distanza dal taglio (colonna a sinistra) e l'intensità di fluorescenza in funzione della distanza dal taglio (colonna destra). Dividere ogni valore grezzo di fluorescenza per il valore massimo di fluorescenza di ottenere l'intensità relativa di fluorescenza. Copiare due colonne corrispondente alla distanza dal taglio (X) e l'intensità di fluorescenza relativa (Y), e quindi incollarli in un software di origine. Montare con il decadimento esponenziale # 1 funzione (Fig. 2D e Fig. 4D.), Che è nella forma: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) dove Y è l'intensità relativa della fluorescenza, Y o è la fluorescenza di fondo, Y max è la fluorescenza massimo relativo, λ è la space (lunghezza) costante, e x è la distanza dal taglio. Confrontare la costante di spazio (λ) valori a diverse condizioni sperimentali utilizzando il t-test o ANOVA (2E Fig. e fig. 4E). Si noti che le tecniche alternative di quantificazione sono stati descritti da altri 13,14. 4. Rappresentante Risultati Esempi rappresentativi di tracciante cellule fotorecettori accoppiamento come determinato dal taglio di carico sono presentati nelle Figure 2 e 3 (pesce) e la figura 4 (coniglio). Confocale immagini sono state scattate utilizzando le stesse impostazioni per il confronto (Fig. 2A-C e fig. 4A-C) e l'intensità di fluorescenza è stata tracciata in funzione della distanza dal taglio e montato dalla funzione esponenziale mostrato in n. 3,8 sopra (Fig. 2D e fig. 4D). Valori di spazio costante per ogni condizionesono illustrati nelle figure 2E e 4E, dimostrazione del fatto che il grado di accoppiamento gap junction tracciante può essere quantificato utilizzando la tecnica del cut-loading. Inoltre, i risultati sono altamente riproducibili. Uso del cut-loading tecnica come un mezzo per quantificare il grado di accoppiamento gap junction tracciante è anche convalidata dalla constatazione che l'intensità di fluorescenza decresce esponenzialmente in funzione della distanza dal taglio in tutti i casi esaminati 7,8 (vedi anche fig. 2D e 4D qui), indicando che neurobiotin entrati i fotorecettori attraverso il taglio rasoio e non da altri siti della retina. Inoltre, l'qualitativamente simile giorno / notte differenza di accoppiamento tracciante cellulare dei fotorecettori osservato in pesci rossi con iniezioni tracciante in coni singoli e con taglio di carico 7 sostanzia cut-carico come un mezzo relativamente accurato per misurare il grado di accoppiamento dei fotorecettori. Il cut-loading tecnica può essere utilizzata anche per studiare altri tipi di sinapsi elettriche nella retina. Per esempio, la Figura 5 mostra che il coniglio di tipo A (Fig. 5A) e di tipo B (Fig. 5B), le cellule orizzontali mostrano omologhi tracciante di accoppiamento seguenti cut-caricamento e la diffusione di neurobiotin sotto adattato all'oscurità condizioni. Composto Pesce Mouse Coniglio NaCl 130 120 117 NaHCO 3 20 25 30 NaH 2 PO 4 – 1 0,5 KCL 2,5 5 3,1 Glucosio 10 10 10 MgCl 2 1 – – MgSO 4-7H 2 O – 1 1,2 Glutammina – 0,1 0,1 CaCl 2 0,7 2 2 Tabella 1: Composizione delle soluzioni della suoneria per pesci rossi, mouse e retine di coniglio. Le concentrazioni sono presentati in mm. Le soluzioni di Ringer sono bollito con 5% di CO 2 / 95% O 2 e mantenuta a 22 ° C (di pesce) o 36 ° C (mammiferi). "-": Non incluso nel Ringer per questa specie. Figura 1:. Diagramma di flusso che mostra il cut-procedura di caricamento. Dopo l'isolamento of la retina neurale intatta, numerosi tagli radiali sono state fatte da una lama che per la prima volta immersa in una soluzione neurobiotin 0,5%. La retina è stato incubato per il caricamento e la diffusione del tracciante, e poi lavato prima di fissazione con paraformaldeide 4% (PFA) in 0.1M tampone fosfato (PB). Tracciante di accoppiamento è stato esaminato con streptavidina coniugata con Alexa-488. Figura 2. Giorno-notte differenza di accoppiamento dei fotorecettori tracciante nel pesce rosso è rivelata dal cut-loading tecnica. Divario di giunzione cellula fotorecettore neurobiotin tracciante accoppiamento era abbondante durante la notte (B) e nel giorno successivo all'applicazione di spiperone (10 micron), un selettivo della dopamina D 2 antagonista del recettore (C), ma non nel giorno in condizioni di controllo (A). D) normalizzato intensità relativa fluorescenza in funzione della distanza dai tagli (indicato dalle frecce in AC). E) val spazio costanteUES desunti dai dati in esperimenti D e altri (n = 4). *** P <0,001. Figura 3. Un esempio rappresentativo che mostra fluorescenza nello strato fotorecettore cella di una dark-adattato retina pesce rosso durante la notte seguente cut-carico con una soluzione di sia neurobiotin e rodamina destrano. Rodamina destrano (mostrato in rosso), che non si diffondono attraverso canali aperti gap junction grazie al suo elevato peso molecolare (> 10.000 MW), solo le cellule etichettate vicino al taglio. Al contrario, neurobiotin (evidenziato in verde) diffusa attraverso giunzioni gap e può essere visto in cellule visive, lontano dal taglio. La posizione del taglio è indicata dalla freccia in ogni pannello. Scala grafica: 200 micron. Figura 4. Giorno-notte differisconoriferimento in fotorecettori tracciante di accoppiamento in retina di coniglio è rivelata dal cut-loading tecnica. Divario di giunzione cellula fotorecettore neurobiotin tracciante accoppiamento era abbondante durante la notte (B) e nel giorno successivo all'applicazione di spiperone (10 mM) (C), ma non nel giorno in condizioni di controllo (A). In AC, vista perpendicolare della ricostruzione 3D dei fotorecettori coniglio vicino al taglio sono mostrati. D) normalizzato intensità relativa fluorescenza in funzione della distanza dai tagli. E) i valori dello spazio costante ottenuta dai dati in esperimenti D e altri (n = 3). *** P <0,001. Figura 5. Cut-loading rivela che adattato all'oscurità coniglio cellule orizzontali sono accoppiate tracciante. Sia di tipo A (A) e tipo B (B), le cellule orizzontali in adattato all'oscurità retine di coniglio esposti omologo neurobiotin accoppiamento tracciante.