잘라내기 -로드 : 망막 뉴런 사이 간격 접합 추적 커플링의 범위를 검토를위한 유용한 도구
Summary
망막 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 결정하는 쉽고 편리한 방법을 설명합니다. 이 기술 하나는 서로 다른 조명 조건과 낮과 밤의 다른 시간대에있는 그대로 망막에있는 뉴런 사이의 전기 시냅스의 기능을 조사 수 있습니다.
Abstract
화학 시냅스 전송뿐만 아니라, 갭 분기점에 의해 연결된 뉴런은 전기 시냅스 전송을 통해 빠른 속도로 통신할 수 있습니다. 증거를 늘리면 간격 분기점뿐만 아니라 전류 흐름과 서로 결합하거나 세포 사이의 동기 활동을 허용함을 나타냅니다지만, 결합 세포 사이의 강도 또는 전기 통신의 효율성 좋은 정도의 1,2에 변조된 수 있습니다. 또한, 많은 간격 연결 채널의 큰 내경 (~ 1.2 nm의)는 간격 분기점은 또한 신진 대사 및 화학 통신을 중재 수 있도록, 세포내 신호 분자와 상호 세포 사이의 작은 metabolites의 보급에도 전류 흐름뿐만 아니라 수 있지만, . 뉴런과 신경 전달 물질 및 기타 요인에 의해 자사의 변조 사이의 간격 junctional 통신의 강도가 동시에 전기 결합 세포에서 기록하여 및 t를 결정하여 연구 수하나의 세포에 주입 iontophoretic 다음 그 간격 접합 투과 아르 추적 분자의 확산 범위 아니지만 막 투과. 그러나 이러한 절차는 그대로 신경 조직의 작은 somata와 뉴런에서 수행하는 매우 어려울 수 있습니다.
다섯 망막 신경 세포 유형의 각각 전기 격차 분기점 3,4로 연결되어 있기 때문에 전기적 시냅스 및 전기 통신의 변조에 대한 많은 연구는 척추 망막에서 실시되었습니다. 증가 증거는 빛의 자극에 망막 및 변경에 circadian (24 시간) 시간은 3-8을 결합 간격 접합을 조절하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 최근 작품은 망막 circadian 시계 D2 수용체 활성을 줄임으로써 증가 도파민 D2 수용체의 활성화에 의해 낮에는로드 및 원뿔 photoreceptor 세포 사이의 간격 접합 커플링을 감소하고, 극적으로 야간로드 – 원뿔형 커플링을 증가시킬 수있다는 것을 보여주었다 <suP> 7,8. 그러나,뿐만 아니라 손상 신경 망막 조직의 작은 somata와 뉴런에서 수행하는 매우 어려운 이러한 연구가 있지만, 그것은 충분히 간격 접합에 빛을 유발 변화를 피하기 위해 단일 망막 뉴런의 electrophysiological 공부하는 동안 조명 조건을 제어하기 어려울 수 컨덕턴스.
여기, 우리는 서로 다른 조명 조건과 낮과 밤의 다른 시간대에 망막 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 결정하는 직접적인 방법을 제시한다. 이 컷 – 로딩 기술은 열 간격 접합 채널을 통해 색소로드 및 확산을 기반으로 9-12 다쳤고, 로딩의 수정입니다. 긁어로드는 그대로 망막으로 두꺼운 조각에서 교양 세포에서 잘 작동하지만,하지 않습니다. 컷 – 로딩 기술은 그대로 생선과 포유 동물 망막 7, 8,13에 photoreceptor 커플링을 연구하는 데 사용되었으며, 사이 커플링 공부하는 데 사용할 수 있습니다여기에 설명된 다른 망막 뉴런.
Protocol
1. 금붕어, 쥐 및 토끼에 대한 완전한 신경 망막의 준비 상수 주변 (배경) 조명 아래에서 설명을 포함하여 다음 단계의 모든 "2) 컷 로딩"을 수행합니다. 이 프로토콜의 목적, 절차 (즉, 매우 어두운 (예 : "scotopic") 조건 하에서 ≤ 0.0001 룩스)를 야간 적외선 고글을 사용하여 지속적인 어둠에서와 같이 수행 설명되어 있지만, 끊임없이 주변 조명의 다른 높은 농도 수준 점에 유의하십시오 간격 접합 추적 커플링에 주변 조명의 다른 수준의 효과를 결정하는 대신 사용할 수 있습니다. 어두운 적응 수술하기 전에 적어도 1 시간에 대한 실험 동물 (금붕어, 마우스 또는 토끼). 마찬가지로 이전에 7 설명한 깊이 tricaine methanesulfonate (MS222, (나트륨 중탄산염 함유) 버퍼된 수조 물 150 MG / L)에서 그들을 배치하여 금붕어를 마취하고, 깊이 케타민을 (100 MG와 마우스를 마취/ kg, IP)와 rompun (10 MG / kg, IP). 깊이 우레탄과 토끼를 (선량로드 : 2.0 g / kg, IP)을 마취 또한 지역 intraorbital 마취 (2 % Xylocaine)를 사용하는 등 이전에 8 설명했다. 동물의 관리 및 사용과 관련된 모든 실험 절차는 연방 지침에 따라 수행되어야하며 지방 대학 동물 관리 및 사용위원회의 검토와 승인을 수 있습니다. (참고 :. 실험이 여기에 설명된에서 물고기의 보호 및 사용에 관련된 모든 실험 절차, 마우스 및 토끼는 NIH의 지침에 따라 수행되었으며 검토되었으며 오하이오 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인) 생선, 마우스 및 토끼 들어, 핵의 제거 다음, 각 안구의 앞쪽에 부분을 제거합니다. 그런 다음, 필터 종이 눈의 후부 부분 아래가되도록, 눈의 뒷부분 부분 위에 필터 종이를 놓고 필터 종이와 눈을 반전. 그렇다면, 괜찮아요 사용포셉 부드럽게 필터 종이에 붙어있는 신경 망막에서 서로에 연결된 안료 상피 / 맥락막 / 공막엔를 물러나고하여 안구의 후부 부분에서 신경 망막 손상을 해부하다. 이것이 완료되면서, 고급 용수철 가위를 사용하여 시신경을 절단. 신경 망막, 중심 photoreceptor 쪽까지가 현재 필터 종이에 붙어 눈의 나머지 부분에서 분리해야합니다. 2. 잘라내기 – 로딩 과 일정한 주위 (배경) 조명 (아주 어두운 (예 : "scotopic") 조건 등)에 따라 30 분 6 잘 플레이트 (~ 5 ML / 음)의 여부에 상관없이 산소 울리는의 솔루션 (표 1) 잠수함은 망막 테스트 약물. parafilm으로 6 잘 판을 밀봉하여 산소의 물고기 망막 (5 % CO 2 / 95% O 2) 중탄산염 기반 울리는가 22의 ° C를 유지하고 5 %의 CO에서 36 ° C에서 마우스와 토끼 망막을 유지 2 / 95% O <suB> 2 인큐베이터. 테스트 약물을 사용하면 고정 때까지 이후의 모든 단계 동안에 존재한다 즉시 망막을 통해 절단하기 전에 울리는의 솔루션에 neurobiotin (0.5 %), biotinylated 분자를 해소하여 추적 솔루션 (일반적으로 100 μL)를 준비합니다. 0.5 %가 rhodamine dextran가 (높은 (> 10,000) MW) 솔루션에 추가할 수 수 있습니다. 높은 분자량으로 인해, rhodamine dextran은 간격 분기점 및 절단에 의해 손상된 경우에만 레이블 세포를 건너하지 않습니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 3 이것은 그들이 부상 되었기 때문에 간격 분기점을 통해 확산하여 추적기 축적된 것을 사람에서 neurobiotin 축적이 세포를 구별할 수있는 유용한 방법입니다. 유리 (또는 플라스틱) 페트리 접시에 neurobiotin 솔루션을 장소, 초과 벨소리를 제거 neurobiotin 솔루션의 면도날 (또는 다른 날카로운 블레이드) 수영 및 종이 타월에있는 망막이 첨부된입니다 필터 종이, 탭N 망막 및 필터 종이를 통해 방사형 몫을합니다. 원하는 경우, 스페이서는 컷이 망막을 통해 만들어진,하지만 필터 종이되도록 사용할 수 있습니다. 상처는 망막 표면에 수직 방향으로해야합니다. 다시 neurobiotin 솔루션에 면도날을 찍어 및 망막에게 두 번째 시간을 했네요. 망막마다 네 상처 (그림을 참조하십시오. 1)이 최대를 반복합니다. 마우스 및 기타 소형 망막을 통해 면도기 인하시 해부 현미경을 사용합니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 잘 6 판 (5 ML 벨소리 / 음)를 사용 또는 테스트 약물없이 1, 잠수함 신선한 벨소리의 중간에 다시 망막,. 로딩 및 확산 수 있도록 15 분에 대한 망막를 품어. 5 분마다 신선한 울리는의 매체 또는 테스트 약물없이 세 번 씻으십시오. RT에서 1 시간을 위해 0.1 M 인산 버퍼 (PBS, pH를 7.4)에 4 % paraformaldehyde로 망막을 수정. 4 박 0.1 M PBS로 씻으 ° C. 그 다음날, 반응 with 2% 0.1M PBS에 streptavidin – 알렉사 488 (최종 농도가 10 μg / ML) + 0.3 % 트리톤 X – 100, 4에서 하룻밤 보관 ° C. 10 분 각각의 RT에서 0.1M PBS로 세 번 씻어 PBS에 좋은 브러쉬를 사용하여 다음 여과지에서 망막을 분리하고, 슬라이드에, 망막, 중심 photoreceptor 쪽 올려 놓습니다. 부드럽게 Vectashield 설치 매체 (벡터 연구소, Burlingame, CA)를 탑재합니다. 의 범위에서, 당신은 다른 실험 조건 (조명 조건 예를 들어, 테스트 약품)의 효과를 비교할 수 있도록, 모든 실험 조건에 대해 동일한 배율, 해상도 및 설정에 공촛점 현미경 (예 : 자이스 혈구 510 META)을 스캔 레이저로 사진을 찍고 갭 접합 추적기 커플링 (그림 2A – C와 그림. 4A – C). 하나의 이미지가 라벨 세포를 모두 포함할 수 있지만, 그것은 당신이 관심 영역의 Z – 스택을 수집하고 단일로 축소하는 것이 좋습니다이미지. 3. ImageJ를 사용하여 추적 커플링의 부량 LSM 이미지 브라우저에서 이미지를 열고 수출 및 파일을 압축되지 TIF – 16 비트로 사진을 저장합니다. 스케일 바이 TIF 이미지에 포함되어야합니다. NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 전체 마운트 망막의 낮은 배율 이미지 알렉사 – 488 – 라벨 neurobiotin의 형광 강도를 측정합니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 TIF 파일을 열고 다음 규모 표시줄에 해당하는 직선을 그립니다. , ANALYSE로 이동 규모를 설정하고 유명한 거리와 길이 단위를 입력한 다음 확인을 누릅니다. 지금 측정 결과는 같은 밀리미터로 보정 단위로 표시하실 수 있습니다. 사각 선택 도구를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 형광의 피크는 선택의 왼쪽 경계에 위치해야합니다. 오른쪽 국경 근처에는 형광 신호가 없다는 것을 확인하십시오. 그렇지 않으면 활성 이미지 (IMAGE 후, 회전)을 돌린다. 를 클릭하십시오ANALYSE와 프로필을 플롯. 당신은 오른쪽으로 왼쪽에서 기하 급수적으로 부패와 커브를 볼 수 있습니다. 팝업 윈도우에서 복사를 클릭하고 Excel에 붙여 넣으십시오. 이제 당신은 그 상처에서 거리의 함수로 컷 (왼쪽 열)과 형광 강도 (오른쪽 열)에서 거리를 보여주는 두 개의 열이을 참조하십시오. 상대 형광 강도를 얻기 위해 최대 형광 값에 의해 각 원시 형광 값을 나누십시오. 다음 컷 (X)와 상대 형광 강도 (Y)의 거리에 해당하고, 복사 두 개의 열이는 원산지 소프트웨어에 그들을 붙여 넣습니다. 지수 붕괴 형태에 # 1 함수 (. 그림 2D 및 그림 4D)와 맞추기 : Y = Y 0 + Y 최대 * EXP (- X / λ) Y의 상대 형광 강도가 어디 있는지, Y O가 배경 형광이며, Y 맥스가 최대 상대 형광이며, λ은 SP입니다ACE (길이) 상수, 그리고 X는 컷의 거리입니다. T – 테스트 또는 ANOVA를 (그림의 2E와 그림. 4E)를 사용하여 다양한 실험 조건에서 공간을 상수 (λ) 값을 비교합니다. 부량의 대체 기법은 다른 13,14에 의해 설명했습니다합니다. 4. 대표 결과 컷 – 로딩에 의해 결정된 커플링 photoreceptor 세포 추적의 대표 예는 그림 2와 3 (생선)와 그림 4 (토끼)에서 제공됩니다. 공촛점 이미지 컷에서 거리의 함수로 꾸몄다 이상 번호 3.8에 표시된 지수 함수에 의해 장착되었습니다 비교 (그림 2A – C와 그림. 4A – C) 및 형광 강도에 대해 동일한 설정을 사용하여 찍은 (그림 2D 및 그림. 4D). 각 조건에 대한 공간 상수 값간격 접합 추적 커플링의 범위는 컷 로딩 기법을 사용하여 계량 수 보여주는, 2E 및 4E 통계에 표시됩니다. 또한, 그 결과는 매우 재현할 수 있습니다. 간격 접합 추적 커플링의 범위를 quantifying의 수단으로 컷 로딩 기법의 사용이 또한 형광 강도는 모든 경우에 컷에서 거리의 함수로 기하 급수적으로 감소 면요에 의해 검증 것은 (또한 무화과를 참조하십시오. 7,8 검사를 neurobiotin 다른 망막 사이트에서 레이저 컷이 아닌 통해 photoreceptors를 입력한 나타내는 여기에 2D 및 4D). 또한, photoreceptor 세포 추적 커플링의 질적 유사한 주 / 야 차이점은 하나의 원뿔로 추적 주사와 금붕어와 컷로드 7 관찰 photoreceptor 커플링의 범위를 측정 비교적 정확한 방법으로 절단 로딩 substantiates. 컷 – 난oading 기술은 또한 망막에 전기 시냅스의 다른 유형을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 5는 토끼 A – 타입 (그림의 5A)와 B 타입 (그림의 5B) 수평 세포 추적이 결합 동종 전시회를 보여줍니다 다음 절단 하중과 어두운 조건에서 적응 neurobiotin의 확산. 화합물 물고기 마우스 토끼 NaCl 130 120 117 NaHCO 3 20 25 30 아니 2 PO 4 – 일 0.5 KCL 2.5 5 3.1 포도당 10 10 10 MgCl 2 일 – – MgSO 4 7H 2 O – 일 1.2 글루타민 – 0.1 0.1 CaCl 2 0.7 이 이 표 1 : 금붕어, 마우스 및 토끼 망막에 대한 울리는의 솔루션 구성. 농도는 MM로 표시됩니다. 벨소리의 솔루션 5 % CO 2 / 95% O 2 부풀어 오른 22 ° C (생선) 또는 36 ° C (포유류)에서 유지됩니다. "-"이 종족에 대한 벨소리에 포함되지 않습니다. 그림 1 :. 컷 로딩 절차를 보여주는 플로우 차트. 절연 O 후F 손상 신경 망막은 여러 가지 방사형 상처가 처음 0.5 % neurobiotin 솔루션있었습니다 칼날에 의해 만들어졌다. 망막은 추적로드 및 확산을위한 incubated 후 0.1M 인산 버퍼 (PB)에 4 % paraformaldehyde (PFA)로 고정하기 전에 세탁했습니다. 추적기 커플링은 알렉사 – 488 streptavidin – 복합 사용하여 조사되었다. 그림 2. 금붕어의 photoreceptor 추적 커플링에 주간 야간 차이는 컷 로딩 기술에 의해 드러났습니다. Photoreceptor 셀 갭 접합 neurobiotin 추적 커플링 제어 조건 (A)에 따라 하루에없는 spiperone (10 μm의), 선택적 도파민 D 2 수용체 길항제 (C) 응용 프로그램의 다음과 박 (B)에서, 하루에 광범위한했지만. 상처 (AC에 화살표로 표시)에서 거리의 함수로 D) 표준화 상대 형광 강도. E) 우주 상수 발D 및 기타 실험 (n은 = 4)에있는 데이터에서 얻은 ues. *** P <0.001. 그림 3. neurobiotin와 rhodamine dextran 모두 솔루션 절단 하중에 따라 야간에 어두운 적응 금붕어 망막의 photoreceptor 세포 레이어에 형광을 보여주는 대표적인 예라고 할 수 있습니다. 높은 분자량 (> 10,000 MW), 컷 근처에만 표시 세포에 의한 열 간격 접합 채널을 통해 확산되지 않습니다 Rhodamine dextran (빨간색 표시). 반면, 갭 분기점을 통해 확산 neurobiotin (녹색 표시)와이 멀리 컷에서 photoreceptor 세포에서 볼 수 있습니다. 절단의 위치는 각 패널에있는 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 : 200 μm의. 그림 4. 일 밤 다릅니다토끼 망막의 photoreceptor 커플링 추적에 줬어는 컷 로딩 기술에 의해 드러났습니다. Photoreceptor 셀 갭 접합 neurobiotin 추적 커플링 제어 조건 (A)에 따라 하루에없는 spiperone (10 μm의) (C) 응용 프로그램의 다음과 박 (B)에서, 하루에 광범위한했지만. AC에서 컷 근처 토끼 photoreceptors의 3D 재건의 수직의 전경이 표시됩니다. 인하의 거리의 함수로 D) 표준화 상대 형광 강도. E) 우주 상수 값을 D 및 기타 실험 (N = 3)의 데이터에서 얻은. *** P <0.001. 그림 5. 잘라내기 – 로딩은 어두운 – 적응 토끼 수평 세포 추적이 결합된다 보여줍니다. A – 타입 (A)과 B 타입 모두 (B) 어두운 적응 토끼 망막의 수평 세포가 동종 neurobiotin 추적 커플링을 전시.
Discussion
여기에서 설명한 컷로드 방법은 서로 다른 조명 조건과 낮과 밤의 다른 시간대에 망막 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 결정하기 위해 유용하고 간단 방법입니다. 이 기법의 장점은 밤낮 동안 조명 조건의 다양한하에 그대로 망막 조직에서 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 정할 작은 직경 somata을 결합하여 뉴런을 위해 그렇게 할 수있는 능력을 포함합니다. 이 일반적인 범주로 그대로 조직 가을에 갭 분기점의 연구 기법의 한계. 첫째, 개방 간격 분기점을 통해 추적 확산이의) 작은 직경이나 열린 채널과 B) 결합 세포 구획의 상대적 볼륨 1,14,15와 관련된 비용으로 인해 관찰 상대적으로 어려울 수 있습니다. 그것은 작은 세포에서 세포의 결합 큰 셀 또는 그룹 광고에 추적 확산이다큰 세포에서 작은 세포로 추적 확산에 ared, 추적 희석으로 인해 검색하는 것이 더 어려울 수 있습니다. 둘째, 어떤 생리 조건 하에서, 손상 조직의 갭 분기점을 통해 추적 확산의 범위가 정확하게 비교적 큰 추적기의 투자율에 비해 작은 전류 운반 이온의 전도성의 차이로 인해 간격 junctional 전도성의 강도를 반영하지 않을 수 있습니다 분자 1,14,15. 일반적으로 추적 커플링의 증거가 강하게 작동하는 오픈 간격 접합 채널의 존재를 암시하지만, 몇 가지 생리적 조건 하에서, 추적 확산은 electrophysiological 레코딩가 작동, 오픈 간격 분기점의 존재를 제안해도 발생하지 않거나 관찰 수 있습니다.
이것은 컷 로딩 기술은 또한 중추 신경 치세요의 다른 지역에서 그대로 조직에서 뉴런 사이의 간격 접합 추적 커플링의 범위를 조사하는 데 사용할 수있는 가능성이 보인다어디서 비롯되었을지.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 심폐소생술에 SCM과 EY018640에 NIH 부여 EY005102에 의해 투자되었다
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L of buffered fish tank water |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | 2 g/kgloading dose |
| Dual Tube Night Vision Goggle | Night Optics USA | D-221 | |
| Filter Paper, Grade No. 4 | Whatman | 1004-090 | |
| Fine Forceps, Dumont No. 5, Biologie, 11 cm long | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Fine Scissors, spring-loaded, 8 mm blade, straight | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Neurobiotin | Vector | SP-1120 | 0.5% |
| Streptavidin-conjugated Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
| Dextran rhodamine(high (> 10,000) MW) | Invitrogen | D1817 | 0.5% |
| Vectashield mounting medium | Vector | H-1000 | |
| Zeiss 510 META Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ImageJ Software | NIH | ||
| OriginPro 8.0 | OriginLab Corp. |
References
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Gap Junction Tracer CouplingRetinal NeuronsElectrical Synaptic TransmissionGap JunctionsElectrical CommunicationModulatedGap Junction ChannelsIntracellular Signaling MoleculesSmall MetabolitesMetabolic CommunicationChemical CommunicationNeurotransmittersCoupled CellsTracer MoleculesIontophoretic Injection
Citer Cet Article
Choi, H. J., Ribelayga, C. P., Mangel, S. C. Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons. J. Vis. Exp. (59), e3180, doi:10.3791/3180 (2012).