Cut-טעינה: כלי שימושי לבחינת היקף Coupling צומת גאפ נותב בין הנוירונים רשתית
Summary
השיטה קלה ונוחה, כדי לקבוע את מידת צימוד צומת הפער נותב בין הנוירונים ברשתית מתואר. טכניקה זו מאפשרת לחקור את הפונקציה של סינפסות חשמליות בין הנוירונים ברשתית שלמים בתנאי תאורה שונים, בזמנים שונים של היום והלילה.
Abstract
בנוסף לשידור כימיים הסינפטי, נוירונים המחוברים על ידי צמתים הפער יכול גם לתקשר במהירות באמצעות העברה סינפטית חשמל. הגדלת הראיות עולה כי הפער לא רק בצמתים היתר זרימת זרם חשמלי ופעילות סינכרונית בין תאים או בשילוב ביניהם, אך כי כוח או היעילות של תקשורת בין תאים חשמליים בשילוב יכול להיות מווסתת על 1,2 במידה רבה. בנוסף, קוטר פנימי גדול (~ 1.2 ננומטר) של ערוצים רבים צומת הפער היתרי לא רק לזרום זרם חשמלי, אלא גם דיפוזיה של מולקולות איתות תאיים ומטבוליטים קטן בין תאים מחוברים, כך צמתים הפער עשוי גם לתווך תקשורת מטבוליים וכימיים . עוצמתה של התקשורת junctional הפער בין נוירונים אפנון על ידי נוירוטרנסמיטורים וגורמים אחרים ניתן ללמוד בו זמנית על ידי חשמלית הקלטה מתאי יחד ועל ידי קביעת tהוא מידת דיפוזיה של מולקולות נותב, שהן צומת הפער חדיר, אבל לא קרום חדיר, בעקבות הזרקת iontophoretic לתוך תאים בודדים. עם זאת, נהלים אלה יכול להיות קשה מאוד לביצוע על נוירונים עם somata קטן רקמה עצבית ללא פגע.
מחקרים רבים על הסינפסות חשמל אפנון התקשורת חשמל נערכו ברשתית חוליות, שכן כל אחד מחמשת סוגי נוירונים ברשתית מחובר חשמלית על ידי הפער צמתים 3,4. ראיות הגדלת הראו כי שעון היממה (24 שעות) ברשתית ושינויים גירוי האור להסדיר צומת הפער מצמד 3-8. לדוגמה, העבודה האחרונה הוכיחה כי שעון היממה רשתית פוחתת צומת הפער צימוד בין מוט ותאי קונוס photoreceptor במהלך היום על ידי הפעלת קולטן דופמין הגדלת D2 ו מגדילה באופן דרמטי את מוט חרוט צימוד בלילה על ידי צמצום הפעלת הקולטן D2 <sup> 7,8. עם זאת, לא רק את המחקרים הללו קשה מאוד לבצע על נוירונים עם somata קטן ברקמת הרשתית העצבית שלם, אבל זה יכול להיות קשה לשלוט באופן הולם את תנאי התאורה במהלך המחקר אלקטרו של נוירונים ברשתית יחיד להימנע אור-Induced שינויים צומת הפער המוליכות.
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לקבוע את מידת צימוד צומת נותב הפער בין הנוירונים ברשתית בתנאי תאורה שונים, בזמנים שונים של היום והלילה. זו טכניקה לחתוך טוען הוא שינוי של טעינת לגרד 9-12, אשר מבוססת על טעינת דיפוזיה לצבוע בערוצים צומת לפתוח פער. טעינת לגרד עובד היטב בתאים בתרבית, אך לא פרוסות עבות כגון הרשתית ללא פגע. הטכניקה לחתוך טעינה נעשה שימוש כדי ללמוד צימוד photoreceptor בדגים שלמים הרשתיות יונקים 7, 8,13, וניתן להשתמש בו כדי ללמוד צימוד ביןנוירונים אחרים ברשתית, כפי שתואר כאן.
Protocol
Discussion
השיטה לגזור טעינת המתוארת כאן היא טכניקה יעילה וישירה על מנת לקבוע את מידת צימוד צומת נותב הפער בין הנוירונים ברשתית בתנאי תאורה שונים בזמנים שונים של היום והלילה. היתרונות של שיטה זו כוללים את היכולת לכמת את מידת צימוד צומת הפער נותב בין הנוירונים ברקמת הרשתית שלם תחת מגוון רחב של תנאי תאורה במהלך היום והלילה ולעשות זאת עבור נוירונים יחד, כי יש somata בקוטר קטן. מגבלות השיטה בחקר צמתים הפער בסתיו רקמות שלמות לשתי קטגוריות כלליות. ראשית, דיפוזיה נותב דרך צמתים הפער פתוח עלול להיות קשה יחסית להבחין בשל קוטר) קטן או תשלום הקשורים הערוצים פתוחים ב) כרכים היחסי של תאים סלולריים בשילוב 1,14,15. כלומר, דיפוזיה נותב מתא לתא קטן גדול או קבוצת תאים יחד, compared דיפוזיה נותב מתא לתא גדול יותר, עשוי להיות קשה יותר לזהות עקב דילול נותב. שנית, תחת כמה תנאים פיזיולוגיים, היקף דיפוזיה נותב דרך צמתים הפער רקמות שלמות לא יכול לשקף במדויק את עוצמת מוליכות הפער junctional בשל ההבדלים המוליכות של קטן הנוכחי נושאת יונים חשמליים, לעומת חדירות של נותב גדול יחסית מולקולות 1,14,15. ככלל, עדות נותב צימוד מראים נוכחות, תפקוד ערוצי פער פתוח בצומת, אך תחת כמה תנאים פיזיולוגיים, דיפוזיה נותב לא יכול להתרחש או לצפות למרות הקלטות אלקטרו מצביעים על נוכחות של, מתפקד צמתים לפתוח פער.
סביר להניח כי הטכניקה לחתוך טעינת יכול לשמש גם כדי לחקור את מידת צימוד צומת הפער נותב בין הנוירונים ברקמות שלמות מאזורים אחרים של sys העצבים המרכזיתTEM.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי NIH כדי להעניק EY005102 SCM ו EY018640 כדי החייאה
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L of buffered fish tank water |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | 2 g/kgloading dose |
| Dual Tube Night Vision Goggle | Night Optics USA | D-221 | |
| Filter Paper, Grade No. 4 | Whatman | 1004-090 | |
| Fine Forceps, Dumont No. 5, Biologie, 11 cm long | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Fine Scissors, spring-loaded, 8 mm blade, straight | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Neurobiotin | Vector | SP-1120 | 0.5% |
| Streptavidin-conjugated Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
| Dextran rhodamine(high (> 10,000) MW) | Invitrogen | D1817 | 0.5% |
| Vectashield mounting medium | Vector | H-1000 | |
| Zeiss 510 META Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ImageJ Software | NIH | ||
| OriginPro 8.0 | OriginLab Corp. |
References
- Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain. Neuron. 41, 495-511 (2004).
- Connors, B. W., Long, M. A. Electrical synapses in the mammalian brain. Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).
- Vaney, D. I. Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin. Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).
- Bloomfield, S. A., Völgyi, B. The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina. Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).
- Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine. Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).
- Xin, D., Bloomfield, S. A. Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).
- Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling. Neuron. 59, 790-801 (2008).
- Ribelayga, C., Mangel, S. C. Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina. PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).
- Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O’Brien, J. Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway. Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).
- Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O’Brien, J. Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP. Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).
- Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes. Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).
- Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimarães, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina. J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).
- Li, H., Chuang, A. Z., O’Brien, J. Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina. J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).
- Mills, S. L., Massey, S. C. The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).
- Mills, S. L., Massey, S. C. A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina. J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).
